TNF-α/NF-κB信号通路在依那西普缓解大鼠类风湿性关节炎中的作用*

刘彩丽， 王颖瑛

(安阳市妇幼保健院检验科， 河南 安阳 455000)

TNF-α/NF-κB信号通路在依那西普缓解大鼠类风湿性关节炎中的作用*

刘彩丽， 王颖瑛△

(安阳市妇幼保健院检验科， 河南 安阳 455000)

目的探讨依那西普(ETN)对胶原诱导大鼠类风湿性关节炎(CIA)的缓解作用及其机制。方法实验动物分为3组(n=10)：①对照组；②生理盐水治疗组(NS组)；③(0.5 mg/kg)依那西普治疗组(ETN组)。其中②和③组的鼠在炎症分值达到两分及以上时随机分组开始治疗。药物采用皮下注射牛Ⅱ型胶原诱导Wistar大鼠建立类风湿性关节炎模型。治疗前和治疗期间每周测量足趾容积和体重，治疗4周后处死，ELISA检测血清TNFα、Ang-1、IL-1β、IL-6、IL-8水平；取足趾部位肌肉提取胞浆和胞核蛋白，Western blot检测NF-κB含量及其亚细胞定位。结果依那西普治疗组较之生理盐水治疗组能显著缓解类风湿性关节炎症症状、降低TNFα以及下游炎症因子水平(P<0.05)；能抑制炎症状况下NF-κB的核内定位增加、胞浆定位减少的状况。结论依那西普可通过抑制TNFα/NF-κB信号通路缓解大鼠类风湿性关节炎。

依那西普；类风湿性关节炎；TNFα/NF-κB信号通路；大鼠

类风湿性关节炎作为一种自身免疫病，其发病率及致残率均较高，近年来国内外学者对其发病机制及治疗的研究均取得了较大的进展，目前认为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α, TNF-α)直接参与了类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)关节及关节软骨的炎症及破坏，NF-κB是RA进展中滑膜炎症的重要炎性细胞因子信号转导通路，依那西普(etanercept，ETN)作为TNFα拮抗剂，通过阻止TNFα与细胞表面的受体结合，减少组织的损伤，以干扰炎症的发生并缓解类风湿性关节炎等疾病，已广泛应用于临床。本文通过胶原诱导建立类风湿性关节炎(collagen induced arthritis, CIA)大鼠模型，研究ETN对TNF-α/NF-κB信号通路的影响，以期对ETN缓解炎症的作用机制有进一步的了解。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

6～7周龄雄性Wistar大鼠，由北京维通利华公司提供，合格证号SCXK(京)2012-0001，体重(170 g±10 g)。饲养环境SPF级动物房，自由饮水进食，室温24℃±2℃。药物：依那西普(Etanercept，恩利)，批号S20130019，由辉瑞制药有限公司提供。试剂：牛Ⅱ型胶原蛋白，Chondrex公司；弗氏完全佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)，美国Sigma公司；酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒、亚细胞结构胞浆和胞核蛋白提取试剂盒(AR0106)，博士德公司；大鼠血管生成素Ang-1 ELISA检测试剂盒(XY-7338)，eBioscience公司；NF-κB一抗(ab7971, 1:400)、β-actin一抗(ab6276, 1∶10 000)，Abcam公司；TATA-binding protein (TBP)一抗(#12578, 1∶1 000)，Cell signaling公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(SA00001-2, 1∶5 000)，Proteintech公司，聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜，Millipore公司。

1.2 类风湿性关节炎模型建立

将用0.1 mol/L冰醋酸溶解的牛Ⅱ型胶原蛋白与等体积的CFA充分乳化，配成终浓度为0.5 g/L的Ⅱ型胶原乳剂。大鼠用水合氯醛(用量0.3 ml/100 g)麻醉后，模型组于大鼠背部及鼠尾根部多点皮下注射配制好的Ⅱ型胶原溶液，总量为1 ml，1周后按上述方法、相同剂量再进行1次，对照组注射等体积生理盐水。第15天开始，大鼠出现关节红肿，发病时间在15～20 d内，第21天统计发病情况，选取类风湿性关节炎指数≥2分的大鼠20只，与注射生理盐水的对照组大鼠10只同时进行后续实验。

1.3 动物分组与处理方法

将建模时注射生理盐水的对照组大鼠标记为正常对照组；将建模成功的类风湿性关节炎大鼠随机分为两组(n=10)：生理盐水治疗组(NS组)和依那西普治疗组(ETN组)。NS组大鼠每天注射等体积生理盐水；给予ETN组大鼠每天尾静脉注射依那西普0.5 mg/kg，治疗4周后处死。

1.4 观察与检测指标

(1)一般观察：观察大鼠体毛的色泽、活动状态、排便及食量的变化情况并每周测定大鼠体重。(2)类风湿性关节炎指数：根据关节肿胀、颜色及关节活动情况记录并评价大鼠全身关节病变程度，每3 d评定1次，共评定7次。评分标准：0分，无红肿；1分，小趾关节稍肿；2分，趾关节和足趾肿胀；3分，踝关节以下的足爪肿胀；4分，包括踝关节在内全部足爪肿胀，4只肢体的病变程度累积积分为类风湿性关节炎指数，最高为16分。21 d后根据类风湿性关节炎指数评分≥2分选取造模成功鼠20只。(3)足趾容积的测定：根据排水法原理，用自制的关节容积测量器测量大鼠左后足双踝连线以下全足容积，从治疗开始，记为第0周，每周测量1次，共5次。(4)血清炎症因子检测：治疗4周，眼内眦静脉丛取血2 ml，4 000 r/min离心15 min，吸取上层血清，依照ELISA试剂盒说明书检测血清TNF-α、Ang-1、IL-1β、IL-6、IL-8含量。(5)免疫印迹法(Western blot)测定足趾部位蛋白NF-κB的亚细胞结构定位以及半定量分析，核蛋白以TBP为内参，胞浆蛋白以β-actin为内参。收取足趾部位肌肉样本，根据柏世德亚细胞结构胞浆和胞核蛋白提取试剂盒说明书，提取胞浆蛋白和核蛋白。30 mg/孔的上样量，12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。20 mA 1 h将蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 三组大鼠的体重比较

生理盐水治疗组大鼠体重在治疗第0、1、2、3、4周明显低于正常对照组(P<0.05)；依那西普治疗组大鼠体重在治疗第4周明显高于生理盐水治疗组(P<0.05，表1)。

2.2 三组大鼠足趾容积比较

生理盐水治疗组大鼠足趾容积在治疗第0、1、2、3、4周明显高于正常对照组(P<0.05)；依那西普治疗组大鼠足趾容积在治疗第2、3、4周明显低于治疗生理盐水治疗组(P<0.05, 表2)。

2.3 三组大鼠血清炎症因子水平的比较

治疗4周后，生理盐水治疗组大鼠血清TNFα、Ang-1、IL-1β、IL-6、IL-8水平显著高于正常对照组 (P<0.05)；依那西普治疗组大鼠血清TNFα、Ang-1、IL-1β、IL-6、IL-8水平显著低于生理盐水治疗组(P<0.05, 表3)。

Tab. 1 The body weight of different groups during CIA treatment (g， ±s, n=10)

CIA: Collagen induced arthritis; NS: Normal saline treatment group; ETN: Etanercept treatment group

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsNS group

Tab. 2 The tone volume of different groups during CIA treatment(g， ±s, n=10)

CIA: Collagen induced arthritis; NS: Normal saline treatment group; ETN: Etanercept treatment group

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsNS-treated CIA group

Tab. 3 The serum levels of TNF-α, Ang-1, IL-1β, IL-6 and IL-8 tested by ELISA (pg/ml，±s, n=10)

TNF-α: Tumor necrosis factor α; Ang-1: Angiopoietin-1; IL-1β: Interleukin 1 beta; IL-6: Interleukin 6; IL-8: Interleukin 8

*P<0.05vsnormal control group；#P<0.05vsNS-treated CIA group

2.4三组大鼠足趾部位NF-κB蛋白表达和定位的比较

外源物种胶原蛋白刺激产生的CIA状态下，鼠足趾组织内NF-κB p105/p50在核内的定位异常增高(P<0.05，图1)，胞浆定位显著低于正常对照组(P<0.05)，治疗4周后，治疗2组NF-κB p105/p50的异常定位显著低于治疗1组(P<0.05)，核内定位的显著降低(P<0.05)，而胞浆定位显著增加(P<0.05)。

Fig.1Western blot of NF-κB 1: Control group; 2: NS group; 3： ETN group； NF-κB: Nuclear factor-kappa B; TBP: TATA-binding protein

3 讨论

TNF-α在炎症反应中起重要作用，可活化炎症细胞，促其分泌趋化因子和黏附分子，是炎性反应中的关键一环。TNF-α是一种具有多种生物活性的促炎因子。在生理情况下，肠道细胞自身分泌的和肠道黏膜淋巴细胞分泌的TNF-α作用于临近的肠道细胞，组成一个复杂的网络系统，调节肠道细胞的增殖和凋亡，对维持肠道屏障起重要作用；在病理情况下，肠道黏膜中多种炎性细胞均可大量分泌TNF-α，在溃疡性结肠炎的发病中具有重要作用。TNF-α的表达主要受NF-κB调控，后者为一类核内的炎性转录因子家族，精密地调控着炎性反应和凋亡信号。黄循铷等[1]采用葡聚糖硫酸钠定量灌胃诱发小鼠急性溃疡性结肠炎模型，测定小鼠结肠通透性，并初步探讨其与炎症因子TNF-α和NF-κB p65的关系。Matsuno等[2]通过动物模型发现TNF-α在RA滑膜炎的发生中起关键作用,TNF-α可激活多形核细胞，刺激滑膜细胞产生前列腺素，并且通过刺激成骨细胞释放Ca2+，抑制碱磷酶和胶原合成造成骨和软骨破坏。NF-κB信号通路是联系细胞因子、炎症反应的桥梁,多种炎症相关疾病与NF-κB 信号通路的过度激活有关,如类风湿性关节炎/干燥综合征、系统性红斑狼疮等[3、4]。静息状态下, NF-κB 与其抑制蛋白IκB(inhiborkbinding，IκB)以非活性的形式存在于胞浆中,当细胞受到炎性因子如TNF-α刺激时, IκB激酶复合物 IKKs被激活,使IκB经快速磷酸化、泛素化后降解，暴露出NF-κB的 DNA 结合域，NF-κB发生核移位并与相应靶基因上特定κB序列结合，参与转录调控，发挥其相关功能[5、6]，本研究发现CIA大鼠血清TNFα、Ang-1、IL-1β、IL-6、IL-8水平显著高于正常对照组，NF-κB也呈现大量活化，并且表现出明显的类风湿性关节炎症，进一步证实TNF-α在类风湿性关节炎患者体内过度表达，并激活NF-κB信号通路，参与RA疾病的发生。依那西普是二聚体融合蛋白，包含可溶性75 kD的肿瘤坏死因子受体Ⅱ(p75-TNFR或TNFR Ⅱ)的细胞外配体结合部分，以及人免疫球蛋白IgG的Fc部分，应用于类风湿性关节炎治疗方面已获得广泛地使用和认可[7]，本研究通过观察，证实依那西普治疗CIA 4周后，血清炎症因子水平较生理盐水治疗组有显著下降；通过对模型鼠的组织样本进行免疫印迹分析发现，依那西普显著改变了TNF-α下游信号分子NF-κB的亚细胞定位。本文通过NF-κB p105/p50抗体检测胞浆和胞核中NF-κB的含量，反映其活性。本研究证实，依那西普特异拮抗TNF-α后，NF-κB p105/p50在核内的定位显著低于生理盐水治疗CIA组，缓解了CIA模型鼠由于外物种胶原蛋白刺激产生的NF-κB p105/p50核内定位的异常增加，而胞浆蛋白的数据与此呼应，CIA模型鼠体内，NF-κB p105/p50胞浆内含量显著低于正常对照组，依那西普处理4周后，NF-κB p105/p50胞浆含量显著升高。结合血清ELISA检测结果，可以初步认识到，依那西普通过拮抗TNF-α，降低NF-κB活性，进一步阻止下游Ang-1、IL-1β、IL-6和IL-8等炎症因子的释放，缓解类风湿性关节炎症进展。

综上所述，本研究证实依那西普通过抑制TNFα/NF-κB信号通路缓解大鼠类风湿性关节炎，近年来，对依那西普的应用范围、机制的问题，国内外学者[8-12]都进行了广泛研究。在个性化治疗和联合用药[13]的趋势下，本文从依那西普治疗类风湿性关节炎的作用机制为研究点，为临床联合用药提供有价值的参考。

[1] 黄循铷, 王承党, 王瑞幸, 等. 溃疡性结肠炎小鼠肠道通透性改变与TNF-α及NF-KB p65的关系[J]. 中国应用生理学杂志, 2016, 32(2): 112-115.

[2] Matsuno H, Yudoh K, Katayama R,etal. The role of TNF-α in the pathogenesis of infammation and joint destruction in rheumatoid arthritis(RA): a study using a human RA/SCID mouse chimera[J].Rheumatology, 2002, 41(3): 329-337.

[3] 张 洁, 孙红英, 江怡雯, 等. NF-κB 在 Sjogren′s 综合征中的表达及意义[J]. 中国临床医学, 2006, 13(2): 300-301.

[4] 唐惠玲. NF-κB信号传导与疾病研究进展[J]. 黑龙江医药科学, 2012, 35(5): 34-36.

[5] Sughra K, Birbach A, de Martin R,etal. Interaction of the TNFR-receptor associated factor TRAF1 with I-kappa B kinase-2 and TRAF2 indicates a regulatory function for NF-kappa B signaling[J].PLoSOne, 2010, 5(9): e12683.

[6] Li X, Commane M, Nie H,etal. Act1,an NF-kappa B-activating protein[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2000, 97(19): 10489-10493.

[7] 依那西普治疗类风湿关节炎和强直性脊柱炎专家组．依那西普治疗类风湿关节炎和强直性脊柱炎的专家建议(2013)[J]． 中华医学杂志， 2013， 93(18)： 1363-1369.

[8] 高晓王君， 解 骏， 肖涟波， 等. TNF-α拮抗剂对胶原诱导大鼠类风湿关节炎骨破坏治疗作用的实验研究[J]． 中国骨质疏松杂志， 2013， 19(5)： 458-464.

[9] 贾峰峰， 张 进， 刘晓宇， 等. 依那西普对炎性疼痛大鼠的疼痛症状及肿瘤坏死因子-α表达的影响[J]． 山西医药杂志， 2014， 43(22)： 2611-2613.

[10]Takeshita M, Suzuki K, Kikuchi J,etal. Infliximab and etanercept have distinct actions but similar effects on cytokine profiles in rheumatoid arthritis[J].Cytokine, 2015, 75(2): 222-227.

[11]梁春祥， 陈克冰， 马伟英， 等. TNF-α拮抗剂(Etanercept)治疗脊髓损伤作用机制的实验研究[J]. 中国骨与关节损伤杂志， 2013, 28(7)： 647-649.

[12]Fautrel B, Pham T, Alfaiate T,etal. Step-down strategy of spacing TNF-blocker injections for established rheumatoid arthritis in remission: results of the multicentre non-inferiority randomised open-label controlled trial (STRASS: Spacing of TNF-blocker injections in rheumatoid arthritis study)[J].AnnRheumDis, 2016, 75(1): 59-67.

[13]Moots RJ, Mays R, Stephens J,etal. Burden of dose escalation with tumour necrosis factor inhibitors in rheumatoid arthritis: a systematic review of frequency and costs[J].ClinExpRheumatol, 2015, 33(5): 737-745.

EffectsofTNF-alpha/NF-kappaBsignalingpathwayonetanerceptalleviatingrheumatoidarthritis

LIU Cai-li, WANG Ying-ying△

(Department of Clinical Laboratory the Maternal and Child Health Hospital of Anyang City, Anyang 455000, China)

Objective: To investigate the effects of etanercept on collagen induced arthritis rats.MethodsThe rheumatoid arthritis model was establishedviasubcutaneous injection of bovine type Ⅱ collagen, and the effects of etanercept was compared through three groups: ①the normal control；②arthritis model treated with saline；③arthritis model treated with etanercept (0.5 mg/kg, intraperitoneal injection) with 10 rats in each group；group②and group③ were selected by arthritis index (≥2)and grouped randomly. The body weight and toe volume were measured at just before and during treatment weekly. Rats were sacrificed after 4 weeks of treatment, and the serum levels of tumor necrosis factor α(TNF-α), angiopoietin-1(Ang-1), IL-1β, IL-6 and IL-8 were tested by ELISA. Nuclear factor-kappa B(NF-κB) levels and subcellular locations in toe muscles were test by Western blot.ResultsEtanercept significantly relieved inflammation of rheumatoid arthritis, lowered the TNF-α and relative inflammatory factors levels compared with saline treatment (P<0.05). The results of Western blot showed that etanercept significantly suppressed the nuclear location of NF-κB p105/p50 caused by inflammation.ConclusionThe anti-inflammatation effect of etanercept may be related to its activity in inhibiting the activation of TNF-α/NF-κB pathway.

etanercept; rheumatoid arthritis; TNF-α/NF-κB pathway; rats

R593.22

A

1000-6834(2017)04-373-04

2017-02-23

2017-06-05

△

Tel: 13569067892; E-mail： 10485536@qq.com

10.12047/j.cjap.5569.2017.090