王 平,郭晓宇,高 宇,刘 剑,山秀杰,张 蕊,葛晓春,冯增斌,李桂芳
(1.承德医学院,河北承德 067000;2.承德医学院附属医院内分泌科 067000 )
利拉鲁肽对高脂喂养大鼠胰腺β细胞ATF4/CHOP通路的影响
王 平1,郭晓宇1,高 宇2△,刘 剑1,山秀杰2,张 蕊2,葛晓春2,冯增斌2,李桂芳2
(1.承德医学院,河北承德 067000;2.承德医学院附属医院内分泌科 067000 )
目的观察利拉鲁肽对高脂喂养大鼠胰腺GRP78、转录活化因子4(ATF4)、CCAAT区/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、TRB3蛋白和mRNA表达情况,探讨利拉鲁肽对高脂喂养大鼠胰腺ATF4/CHOP通路的影响。方法将雄性Wistar大鼠44只分为对照组、高脂组、干预组1、干预组2,每组11只,对照组给予普通饮食,其余3组给予高脂饮食喂养8周后,干预组1给予利拉鲁肽100 μg·kg-1·d-1皮下注射;干预组2给予利拉鲁肽200 μg·kg-1·d-1皮下注射。药物干预2周后处死,每组取5只大鼠行清醒状态下高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验计算葡萄糖输注率(GIR),测定其余大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、血清游离脂肪酸(FFA)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),计算胰岛β细胞功能指数(HOMA-β),Western blot和Realtime-PCR技术检测胰腺GRP78、ATF4、CHOP和TRB3蛋白及mRNA的表达。结果与对照组相比,高脂组FBG、FFA、TC、FINS、TG、LDL-C水平显著升高,HDL-C、GIR和HOMA-β明显下降(P<0.05或P<0.01),与高脂组相比,干预组2 HDL-C、GIR和HOMA-β升高(P<0.05或P<0.01),其余指标明显下降;与干预组1相比,干预组2的血FGB、FFA、TC下降,GIR和HOMA-β升高(P<0.05)。与对照组相比,高脂组GRP78、ATF4、CHOP和TRB3蛋白及mRNA的表达明显升高;与高脂组相比,干预组1与干预组2随利拉鲁肽浓度升高,GRP78、ATF4、CHOP和TRB3蛋白及mRNA表达逐渐下降。结论利拉鲁肽可呈浓度依赖性改善高脂喂养大鼠胰岛素抵抗及保护胰岛β细胞,其作用机制可能涉及胰腺内质网ATF4/CHOP通路。
胰岛素抗药性;内质网应激;转录活化因子-4;CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白;利拉鲁肽
2型糖尿病是一种进展性疾病,胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)和胰岛β细胞功能减退是两个主要发病机制。近年来研究发现,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)可促进IR和β细胞凋亡,导致胰岛功能衰竭[1]。胰高血糖素样多肽-1(GLP-1)类似物利拉鲁肽是治疗2型糖尿病的新型降糖药,该药物可抑制胰腺β细胞凋亡,保护胰岛β细胞功能并改善IR,但具体机制不明[2]。本实验利用利拉鲁肽对高脂喂养IR大鼠进行干预,观察其对ERS相关转录活化因子4(ATF4)/CCAAT区/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)通路的影响,探讨利拉鲁肽改善IR保护胰岛β细胞的可能机制,为其治疗糖尿病提供理论依据。
1.1动物与饲料 Wistar雄性大鼠44只,购于北京维通利华。普通饲料组成:总热量为337 kCal/100 g,碳水化合物64.19%,脂肪12.04%,蛋白质23.77%。高脂饲料组成:总热量为486 kCal/100 g,碳水化合物30.01%,脂肪53.75%,蛋白质16.24%。普通饲料及高脂饲料购于北京科奥协力有限公司。
1.2实验分组 大鼠适应性喂养3 d,分为对照组、高脂组、干预组1、干预组2,每组11只。对照组给予普通饮食,高脂组、干预组1、干预组2给予高脂饲料喂养,喂养8周后,对照组给予普通饮食+生理盐水每日皮下注射,高脂组给予高脂饮食+生理盐水每日皮下注射,干预组1给予高脂饮食+利拉鲁肽100 μg·kg-1·d-1皮下注射,干预组2给予高脂饮食+利拉鲁肽200 μg·kg-1·d-1皮下注射。药物干预2周后各组取5只大鼠行清醒状态下高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验计算葡萄糖输注率(GIR),判定大鼠胰岛素抵抗情况。腹主动脉取血处死各组其余大鼠,快速分离胰腺组织迅速置于-80 ℃液氮中随后转移到-80 ℃冰箱中保存,用于Western blot和Real-time PCR检测。
1.3清醒状态高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验 参照文献[3]进行。
1.4血液相关指标的测定 全血标本室温放置2 h,1 000 r/min离心20 min,取上清液,-80 ℃冰箱保存。使用全自动生化分析仪采用FINS法测定空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。血清游离脂肪酸(FFA)用ELISA试剂盒测定(购于南京建成生物工程研究所)。
1.5胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)计算 HOMA-β=20×FINS/(FBG-3.5)。
1.6Western blot分析 将冻存的胰腺剪成小块,取100 mg组织加入1 mL蛋白裂解液,冰上裂解30 min,4 ℃ 12 000 r/min离心10 min,取上清液,严格按照BCA法测定蛋白浓度。进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),每孔上样40 μg,样品分离后转移至PVDF膜,设置电压100 V,总电泳时间2 h左右。封闭、TBST洗膜分别加入GRP78一抗、ATF4一抗、CHOP一抗、TRB3一抗和β-actin一抗(购于武汉博士德生物工程有限公司)室温摇床孵育2 h,TBST洗膜3次,分别加入二抗(购于武汉博士德生物工程有限公司)4 ℃摇床过夜,TBST洗膜3次。在暗室中,ECL发光剂在X光胶片曝光。以β-actin为内参对照,将胶片扫描后用Image J软件分析。
1.7Real-time PCR检测 按照 Trizol说明书从胰腺组织提取总RNA。应用Fast Quant RT kit反转录试剂盒(天根生化科技有限公司)反转录合成cDNA,反应体系20 μL,严格按照说明书反转录合成cDNA,以此为模板进行RT-PCR,以β-actin作为内参。每个循环 94 ℃变性15 s,68 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s。利用检测到的荧光信号,得到每份标本的扩增曲线及熔点曲线,检测反应的特异性,得到各自的Ct值,每组均重复3次进行。引物由Invitrogen公司设计合成,引物序列如下:GRP78上游5′-AAC CCA GAT GAG GCT GTA GCA-3′,下游5′-ACA TCA AGC AGA ACC AGG TCA C-3′;ATF4上游5′-GCA TCT GTA TGA GCC CTG AGT CC-3′,下游5′-CCA CGA GGA ACA CCT GGA GAA G-3′;CHOP上游5′-CCT CGC TCT CCA GAT TCCA-3′,下游5′-CTC ATT CTC CTG CTC CTT CTC C-3′;TRB3上游5′-TCA AGT TGC GTC GAT TTG TCT TC-3′,下游5′-CAG TCA TCA CAC AGG CAT CCT C-3′;β-actin上游5′-ATG CCA TCC TGC GTC TGG ACC TGG C-3′,下游5′- AGC ATT TGC GGT GCA CGA TGG AGG G-3′。得出Ct值通过公式2-ΔΔCt分析计算各目的基因相对表达量。
2.1一般项目 与对照组相比,高脂组的血FBG、FFA、TC、TG、FINS、LDL-C均显著升高,HDL-C、HOMA-β和GIR明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);与高脂组相比,干预组2血FBG、FFA、TC、FINS、TG、LDL-C均明显下降,HOMA-β和GIR升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);干预组1血FFA下降,HOMA-β和GIR明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与干预组1比较,干预组2大鼠的FBG、FFA、TC明显下降,HOMA-β和GIR明显升高(P<0.05),见表1。
表1 4组大鼠一般项目比较
a:P< 0.05,与对照组比较;b:P<0.01,与对照组比较;c:P<0.05,与高脂组比较;d:P<0.01,与高脂组比较;e:P<0.05,与干预组1比较
2.2各组大鼠胰腺ERS相关因子mRNA的表达 与对照组相比,高脂组胰腺GRP78、ATF4、CHOP、和TRB3 mRNA显著升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与高脂组比较,干预组1和干预组2的GRP78、ATF4、CHOP和TRB3 mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与干预组1比较,干预组2 GRP78、ATF4、CHOP和TRB3的mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05),见图1。
*:P<0.05,与对照组比较;#:P<0.05,与高脂组比较;△:P<0.05,与干预组1比较
图1各组大鼠胰腺ERS相关因子mRNA的表达
2.3各组大鼠胰腺ERS相关蛋白表达情况 Western blot检测4组大鼠胰腺组织中GRP78、ATF4、CHOP和TRB3蛋白相对表达水平的比较:与对照组比较,高脂组GRP78、ATF4、CHOP、和TRB3的蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05),经利拉鲁肽干预后,干预组1和干预组2 GRP78、ATF4、CHOP、和TRB3蛋白表达均下调,明显低于高脂组,差异有统计学意义(P<0.05)。与干预组1比较,干预组2各组蛋白减少(P<0.05),见图2。
图2 各组大鼠胰腺ERS相关蛋白表达情况
研究发现高脂饮食可导致机体代谢改变及IR和胰岛β细胞功能紊乱,同时高脂环境是机体诱发IR的独立危险因素之一[4-6]。HOMA-β是用于评价个体的胰岛β细胞功能的指标,胰岛β细胞功能降低则其数值降低,功能增强则其数值升高。钳夹实验中GIR是国际上评价IR的金标准,数值越低提示IR越明显。本实验结果显示,高脂喂养大鼠与对照组相比,GIR、HOMA-β下降,FINS升高,出现了高胰岛素血症、IR及胰岛β功能减退。同时出现FFA、TC、TG、LDL-C均显著升高,HDL-C显著性降低的血脂紊乱。利拉鲁肽是一种长效GLP-1类似物,利拉鲁肽干预高脂喂养大鼠2周后,GIR升高,FINS下降,HOMA-β升高,血糖、血脂降低,HDL-C升高,且与100 μg·kg-1·d-1的利拉鲁肽组比较,200 μg·kg-1·d-1利拉鲁肽干预效果更明显,这表明利拉鲁肽呈浓度依赖性降低高脂饮食大鼠血糖、血脂,有效改善IR和胰岛β功能减退,与既往的结果相似[7]。
研究发现高糖、高脂等应激情况下,内质网平衡被打破,使内质网内蛋白质折叠错误并堆积在内质网腔内,持续应激引发ERS及细胞凋亡[8]。分子伴侣葡萄糖调节蛋白(GRP78)是ERS标志性蛋白。已有相关研究证实高脂条件下,大鼠胰腺发生IR,内质网应激相关因子GRP78表达升高,激活内质网应激相关通路,引起胰岛功能衰退,导致糖尿病,本研究结果与之相似,高脂大鼠胰腺GRP78表达升高,这说明IR和胰岛功能减退与ERS密切相关[9]。双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)是内质网膜上的一种Ⅰ型跨膜蛋白,是ERS的3条通路之一,持续的ERS可使PERK激活下游真核起始因子2α(elF2α)和转录活化因子-4(ATF4)、前凋亡因子CCAAT增强结合蛋白同源蛋白(CHOP)和调解凋亡基因假性激酶Tribbles 3(TRB3),CHOP和TRB3均参与细胞凋亡[10-12]。国外学者认为,脂毒性较糖毒性更易诱发ERS,参与细胞凋亡,导致IR和胰岛功能衰退,出现糖尿病[8-9]。已有研究发现,在INS-1细胞,棕榈酸诱导GRP78、ATF4、CHOP表达升高,提示FFA引发的ERS反应可能在脂毒性所导致的β细胞凋亡的过程中发挥重要作用[13]。本实验结果发现,在高脂情况下,血中FFA升高,脂代谢紊乱,大鼠胰腺GRP78、ATF4、CHOP和TRB3的蛋白和mRNA均明显升高,说明高脂引起凋亡相关蛋白和基因的表达异常诱发ERS,可能参与IR和胰岛细胞功能下降有关,与上述研究结果相一致。
Moffett等[14]发现利拉鲁肽可减少糖尿病大鼠胰腺β细胞的凋亡,保护胰岛β细胞,但是相关机制尚未阐明。本实验发现利拉鲁肽干预后,GRP78、 ATF4、CHOP的蛋白和mRNA及表达明显下降,提示GLP-1受体激动剂利拉鲁肽可能通过ATF4/CHOP通路缓解ERS来保护胰岛β细胞功能。已有研究发现TRB3不仅参与动脉硬化病理变化,而且与IR、糖尿病密切相关[15]。本研究发现应用利拉鲁肽后不仅改善IR,而且下调了TRB3的表达,但二者之间的具体机制尚不清楚,需进一步研究。近期临床试验也证实,利拉鲁肽一方面调节紊乱的血脂、血糖,改善IR等心血管危险因素,另一方面也改善患者的胰岛β细胞功能[16-18]。
综上所述,高脂饮食出现脂代谢紊乱和胰岛素抵抗和胰岛细胞功能受损,应用利拉鲁肽后改善IR,调节糖脂代谢,缓解胰腺ERS,抑制ATF4-CHOP-TRB3通路基因的表达,减少胰岛细胞凋亡起到保护胰岛细胞功能作用,但是利拉鲁肽在其他组织中是否通过相同机制改善IR减轻内质网应激,有待进一步研究。
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EffectsofliraglutideonATF4/CHOPpathwayofpancreaticbetacellsinratsfedwithhigh-fatdiet
WangPing1,GuoXiaoyu1,GaoYu2△,LiuJian1,ShanXiujie2,ZhangRui2,GeXiaochun2,FengZengbin2,LiGuifang2
(1.ChengdeMedicalUniversity,Chengde,Hebei067000,China;2.DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalUniversity,Chengde,Hebei067000,China)
ObjectiveTo observe the effects of liraglutide on GRP78,ATF4,CHOP and TRB3 protein and mRNA expression in rats which fed with high fat diet,and to explore the effect of liraglutide on ATF4/CHOP pathway of pancreas in rats fed with high fat diets.MethodsForty-four male Wistar rats were randomly divided into the control group,high fat group,intervention group 1 and intervention group 2,11 cases in each group.The control group was fed with common food,other 3 groups were fed with high fat diet for 8 weeks.Then the intervention group 1 was given with liraglutide (100 μg·kg-1·d-1) by subcutaneous injection;the intervention group 2 was given liraglutide (200 μg·kg-1·d-1) by subcutaneous injection.After 2 weeks medication intervention,the rats were killed.Five rats were taken from each group and performed the hyperinsulinemic englycemic clamp experiment under waking state for calculating the glucose infusion rate(GIR).The fasting blood glucose(FBG),fasting insulin(FINS),serum free fatty acid(FFA),total cholesterol(TC),triglyceride(TG),low density lipoprotein cholesterol(LDL-C) and high density lipoprotein(HDL) were examined,and islet beta cell function index(HOMA-β) were calculated.PCR and Western blot method were used to detect the expression of pancreas GRP78,ATF4,CHOP and TRB3 protein and mRNA.ResultsCompared with the control group,the levels of FBG,FFA,TC,FINS,TG and LDL-C in the high fat group were significantly increased,the levels of HDL-C,GIR and HOMA-β were significantly decreased(P<0.05 orP<0.01);compared with the high fat group,the levels of HDL-C,GIR and HOMA-β in the intervention group 2 were increased(P<0.05 orP<0.01),the other indicators were significantly decreased;compared with the intervention group 1,blood FGB,FFA,TC in the intervention group 2 were decreased,while the levels of GIR and HOMA-β were increased(P<0.05).Compared with the control group,expression of GRP78,ATF4,CHOP and TRB3 protein and mRNA in the high fat group were significantly increased;compared with the high fat group,the expression of GRP78,ATF4,CHOP and TRB3 protein and mRNA in the intervention group 1 and 2 were gradually decreased with the liraglutide concentration increase.ConclusionLiraglutide can improve insulin resistance and protect pancreatic beta cells in a concentration-dependent manner,its mechanisms may involve in the pancreatic endoplasmic reticulum ATF4/CHOP pathway.
insulin resistance;endoplasmic reticulum stress;ATF4;CCAAT/EBP homologous protein;liraglutide
10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.004
R322.57
A
1671-8348(2017)27-3755-04
2016-11-19
2017-04-07)
王平(1990-),在读硕士,主要从事糖尿病与脂代谢方面研究。△
,E-mail:yugao815@163.com。