菌种和发酵条件对菜籽粕中植酸和单宁的影响

孙 林，刘 平，陈金和，卓伟伟，吴海明

（1.江西农业工程职业学院，江西 樟树 331200；2.江西四特酒业有限责任公司，江西 樟树 331200）

营养与饲料

菌种和发酵条件对菜籽粕中植酸和单宁的影响

孙 林1，刘 平1，陈金和1，卓伟伟1，吴海明2

（1.江西农业工程职业学院，江西 樟树 331200；2.江西四特酒业有限责任公司，江西 樟树 331200）

利用植物乳酸菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉菌、酿酒酵母菌对菜籽粕进行单菌固态发酵，采用3因素3水平的拉丁方设计，观察接种量、麸皮添加量、发酵时间对发酵菜籽粕中植酸和单宁含量的影响。结果表明，枯草芽孢杆菌是去除植酸的最优菌种，以9%接种量、15%麸皮添加量、发酵48 h效果最好，植酸去除率63.2%；黑曲霉菌为去除单宁的最优菌种，以9%接种量、10%麸皮添加量、发酵48 h效果最好，单宁去除率77.3%。

植酸；单宁；发酵；菜籽粕

AbstractThe solid-state fermentation of rapeseed meal was carried out by using four kinds of strains of Lactobacillus plantarum,Bacillus subtilis,Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae.Using three factors three levels of Latin square design,the effects of inoculation amount,amount of bran added and fermentation time on phytic acid and tannin content in rapeseed meal were observed.The results showed Bacillus subtilis was the best strain to remove phytate,9%inoculation amount,15%bran addition amount,fermentation 48 h for the appropriate fermentation conditions,that the removal rate of phytic acid are 63.2%;Aspergillus niger was the best strain to remove tannin,9%inoculation amount,10%bran addition amount,fermentation 48 h for the appropriate fermentation conditions,that the removal rate of tannin are 77.3%.

Key wordsphytic acid;tannin;fermentation;rapeseed meal

我国油菜产量居世界之最，每年油菜籽制油可产生600多万t的菜籽粕[1]，是国内主要的优质植物蛋白质饲料资源之一，蛋白质含量较高，氨基酸组成较平衡[2]，然而菜籽粕中含有多种抗营养因子，严重限制了菜籽粕在动物生产中的应用。去除菜籽粕中多种抗营养因子是利用菜籽粕的重要途径。

目前对菜籽粕的脱毒方法主要分为物理脱毒、化学脱毒和生物学脱毒等。物理法效果不明显，营养成分损失大，不能充分利用资源[3]。化学脱毒法具有成本高、污染严重的缺点[4]。生物学方法分为酶法和微生物发酵法。近年来人们采用添加植酸酶和木聚糖酶等方法来提高菜籽粕饲用价值[5-6]，取得一定效果，但酶价格昂贵不利于推广。微生物发酵法具有成本小、操作简单的优点，是理想的脱毒方法，备受青睐。国内外对菜籽粕的脱毒研究较多，主要集中在脱除硫甙、异硫氰酸酯和噁唑烷硫酮[7]。

随着双低油菜的推广及去除硫甙的研究初见成效，菜籽粕中植酸和单宁的抗营养作用逐渐凸显出来。本文选用植物乳酸菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉菌、酿酒酵母菌对菜籽粕进行固态发酵试验，研究菌种和发酵条件对菜籽粕中植酸和单宁的影响，为更好地开发利用菜籽粕这一优良的蛋白质资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2016年3月16日至2017年5月15日在江西农业工程职业学院农科实训楼微生物实验室进行。

1.2 试验材料

1.2.1 原料 菜籽粕：由江西金佳谷物股份有限公司提供，水分含量11.2%，粗蛋白质含量36.2%，植酸含量为2.26%，单宁含量6.57 mg/g。麸皮：本地市售，含水量12.6%，植酸含量为2.17%。原料粉碎过40目筛备用。

1.2.2 菌种 植物乳酸菌（Lactobacillus plantarum）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为江西农业工程职业学院微生物实验室筛选保存菌种。黑曲霉菌（Aspergillus niger）、酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）由江西四特酒业有限责任公司提供。

1.2.3 培养基 植物乳酸菌用MRS培养基，黑曲霉菌用察氏培养基，枯草芽孢杆菌用牛肉膏蛋白胨培养基，酿酒酵母菌用麦芽汁培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 种子及种子液的制备 植物乳酸菌接种到MRS液体培养基，38℃，静置培养48 h；黑曲霉菌接种到察氏培养基培养，28℃、120 r/min振荡培养48 h；酿酒酵母菌接种到麦芽汁培养基，30℃、120 r/min振荡培养48 h；枯草芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基，30℃、120 r/min振荡培养48 h。从上述培养好的菌液中，以5%的接种量分别接到各菌的发酵种子培养液中（培养基成分同各菌增殖培养基），培养24 h，制成发酵种子液。

1.3.2 固态发酵培养 将菜籽粕、麸皮（按不同添加量的配比）装入200 mL锥形瓶中，混合均匀，按水料比1.5∶1加入水分，塞紧棉塞后外裹牛皮纸封口，115℃灭菌20 min，冷却破块打散，将各菌的发酵种子液（按不同的接种量）接入发酵培养基中，34℃进行单菌的发酵试验，搅拌均匀，静置发酵。发酵过程中定时（24 h、36 h、48 h）取样，烘干粉碎，测定样品中植酸和单宁的含量。

1.4 试验设计

采用2重复的3因素3水平的拉丁方设计，研究接种量、培养基麸皮添加量、发酵时间对植物乳酸菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉菌、酿酒酵母菌发酵菜籽粕效果的影响，测定发酵菜籽粕中植酸、单宁的含量变化，具体见表1。

表1 多因素拉丁方设计

1.5 菜籽粕中主要抗营养因子的测定方法

植酸的测定方法采用三氯化铁比色法[8]。单宁的测定方法：按GB/T 15686—1995[9]进行。

1.6 统计分析

结果以平均数±标准差表示，数据处理与分析采用SAS 4.24的GLM程序进行，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与讨论

2.1 菌种和发酵条件对菜籽粕中植酸的影响

表2结果显示，对同一因素不同水平的植酸含量取平均值进行比较，枯草芽孢杆菌对植酸的降解效果要优于其他菌种，发酵样品植酸含量低于其他3种试验菌种。Kerovuo等（1998）研究发现枯草芽孢杆菌能产生植酸酶，可以分解植酸，释放其中的磷，提高动物对磷的吸收利用[10]。Ashok等（2001）、Kim等（1998）等也有相同的发现[11-12]。国内也做了这方面的研究。范继英等（2006）发现了能产生植酸酶的枯草芽孢杆菌菌株[13]。这些研究结果与本试验的结果相符合，枯草芽孢杆菌对植酸的降解效果明显。同时试验发现，接种量、麸皮添加量及发酵时间对枯草芽孢杆菌降解菜籽粕中植酸的影响显著。其次，植物乳酸菌和黑曲霉菌对植酸的降解也有一定作用，效果次于枯草芽孢杆菌，国内外也有研究发现黑曲霉菌、乳酸杆菌也能够分泌植酸酶[14-15]。酿酒酵母菌对植酸的降解效果最差，植酸含量基本无变化。这可能与酿酒酵母菌的酶系主要为糖酶有关，其对植酸的利用率较低。因此，枯草芽孢杆菌是去除植酸的最优菌种。

表2 菌种和发酵条件对各菌种去除发酵菜籽粕中植酸的影响 %

2.1.1 接种量对不同菌种去除植酸的影响 由图1可知，接种量对植酸的去除效果影响明显的是枯草芽孢杆菌和植物乳酸菌，各接种量水平间植酸含量差异显著（P<0.05）。枯草芽孢杆菌在接种量为9%时，发酵菜籽粕中植酸含量下降了62.2%（P<0.05）。接种量对植酸降解率影响较小是黑曲霉菌，黑曲霉菌在接种量为6%时，菜籽粕中植酸含量显著低于接种量为 3%时（P＜0.05），但与 9%时植酸含量对比不明显（P＞0.05）。酿酒酵母菌各接种量水平对植酸的去除率均较低，各接种量水平间含量差异不显著（P＞0.05）。因此高接种量水平对枯草芽孢杆菌和植物乳酸菌去除菜籽粕中植酸是必要的。

图1 接种量对各菌降解菜籽粕中植酸的影响

2.1.2 麸皮添加量对不同菌种去除植酸的影响固体发酵基质麸皮的作用一是为微生物发酵提供必要的氮源；二是改变发酵基质致密的结构，改变基质张力，并使基质疏松多孔，为好氧菌的生长提供适宜的环境。因此麸皮添加量也是决定固态发酵成功与否的关键因素之一。从图2和表2可见，麸皮添加量对枯草芽孢菌去除植酸的影响显著（P＜0.05），随着麸皮添加量增多，植酸去除率明显提高，这可能与枯草芽孢杆菌的好氧性有关，麸皮添加量的增多使发酵基质更加疏松多孔，利于好氧菌的生长，在麸皮添加量为15%时植酸的去除率显著高于其他麸皮添加量水平的结果（P＜0.05）。但高麸皮添加量却不利于植物乳酸菌等厌氧菌的生长，植物乳酸菌对植酸的去除率随着麸皮添加量的增多而下降，麸皮添加量为15%时菜籽粕的植酸含量显著高于麸皮添加量为5%时菜籽粕中植酸含量（P＜0.05）。黑曲霉菌和酿酒酵母菌对植酸的降解受麸皮添加量的影响较小，这可能与真菌类生物对氧的敏感度程度较低有关。

图2 麸皮添加量对各菌降解菜籽粕中植酸的影响

2.1.3 发酵时间对不同菌种去除植酸的影响 如图3所示，发酵时间对植物乳酸菌、枯草芽孢杆菌去除植酸的影响显著（P＜0.05），各发酵时间水平菜籽粕中植酸含量差异显著（P＜0.05），枯草芽孢杆菌在发酵48 h植酸去除率达到63.1%。黑曲霉菌在发酵36 h对植酸的去除率与发酵48 h对植酸的去除率差异不显著（P＞0.05），表明黑曲霉菌对植酸的降解能力达到饱和，对植酸的降解能力有限。酿酒酵母菌对植酸的去除率较差，且随着发酵时间延长菜籽粕中植酸含量无明显变化，表明酿酒酵母菌对植酸的去除效果并不会随着发酵时间延长而改善，其对植酸的去除作用较弱。

图3 发酵时间对各菌去除菜籽粕中植酸的影响

2.2 菌种和发酵条件对菜籽粕中单宁的影响

由表3结果可知，黑曲霉菌对发酵菜籽粕中单宁的降解明显优于其他菌种，发酵48 h单宁降解率达到76.7%。国内研究发现，黑曲霉菌能产生单宁酶及植酸酶[16-17]，这与试验结果相符合，在本试验中黑曲霉菌对单宁的去除能力优于对植酸的去除能力，表明黑曲霉菌分泌单宁酶的能力优于其分泌植酸酶的能力。植物乳酸菌和酿酒酵母菌对单宁的降解能力较黑曲霉菌差异明显，这与植物乳酸菌和酿酒酵母菌的酶系多以淀粉酶等糖酶为主有关[18]，对单宁这类多酚类抗营养因子的处理能力不足。国内外研究发现，植物乳酸菌对硫甙这种糖类衍生物的抗营养因子处理效果上反而比较突出[19-20]，而酿酒酵母菌对淀粉类多糖的利用率较高。枯草芽孢杆菌对单宁的处理效果最差，单宁含量基本无变化，这与枯草芽孢杆菌的酶系主要为蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶有关[21]。国内有研究发现，枯草芽孢杆菌对单宁无法利用，高剂量的单宁反而对枯草芽孢的生长造成抑制[22]。因此，黑曲霉菌对单宁的去除效果最好。

2.2.1 接种量对不同菌种去除单宁的影响 从表3和图4试验结果可以看出，接种量对黑曲霉菌去除菜籽粕中单宁的影响显著，各接种量水平间单宁的含量差异显著（P<0.05），接种量达到9%时单宁降解率达到76.4%，比接种量3%时降解率66.1%高出10.3个百分点。而植物乳酸菌在接种量为9%时与接种量为3%和6%时差异显著（P<0.05）。而枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的各接种量间单宁的去除率差异不显著。因此，高接种量水平的黑曲霉菌对去除菜籽粕中的单宁是必不可少的。

表3 菌种和发酵条件对各菌种去除发酵菜籽粕中单宁的影响 mg/g

图4 接种量对各菌降解菜籽粕中单宁的影响

2.2.2 麸皮添加量对不同菌种去除单宁的影响 由表3可知，麸皮添加量对各菌种去除菜籽粕中单宁的影响不显著，只有当麸皮添加量达到10%时对黑曲霉菌的影响较大，与5%的麸皮添加量时菜籽粕中单宁的含量差异显著（P<0.05），表明添加适量的麸皮有利于黑曲霉菌的生长和酶系中单宁酶的分泌。

2.2.3 发酵时间对不同菌种去除单宁的影响 图5和表3结果所示，发酵时间对黑曲霉菌、植物乳酸菌、酿酒酵母菌去除单宁的影响显著，其中对黑曲霉菌的影响最大，各发酵时间水平单宁的含量差异显著（P<0.05），而植物乳酸菌和酿酒酵母菌在发酵48 h时与发酵24 h和36 h时差异显著（P<0.05）。因此要保证各菌对单宁的去除效果，应当适度延长发酵时间。

图5 发酵时间对各菌去除菜籽粕中单宁的影响

3 小结

本试验条件下，发酵菜籽粕中的植酸和单宁均得到不同程度的降解。枯草芽孢杆菌为去除植酸的最优菌种，以9%接种量、15%麸皮添加量、发酵48 h为较适宜的初步发酵条件，植酸含量0.83%，去除率达63.2%；而黑曲霉菌为降解菜籽粕中单宁的优势菌种，以9%接种量、10%麸皮添加量、发酵48 h为较适宜的初步发酵条件，单宁去除率77.3%。

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（编辑：富春妮）

Effects of Strains and Fermentation Conditions on Phytic Acid and Tannin in Rapeseed Meal

SUN Lin1,LIU Ping1,CHEN Jinhe1,ZHUO Weiwei1,WU Haiming2
(1.Jiangxi Agricultural Engineering College,Zhangshu 331200,China;2.Jiangxi Sitir Liquor Limited Company,Zhangshu 331200,China)

S816

A

1002-1957(2017)05-0009-04

2017-09-08

孙 林（1982-），男，山东烟台人，讲师，硕士，研究方向为动物营养及饲料科学.E-mail:what198219@163.com