牛奶中硝基咪唑类药物的测定

文/贾 涛

（北京市饲料监察所）

牛奶中硝基咪唑类药物的测定

文/贾 涛

（北京市饲料监察所）

牛奶样品经乙酸乙脂提取、正己烷去脂、MCX净化小柱净化后过膜，注入液相色谱串联质谱检测仪。试验显示：浓度为0、2.0、4.0、20.0、40.0、200.0、400.0 ng/mL标准曲线相关系数R2值均大于0.995；回收率为86.7%～89.2%，变异系数小于15%，试验结果表明该方法能够达到灵敏度、准确度和精密度的要求。

牛奶；硝基咪唑；测定分析

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑、羟基地美硝唑对照品：纯度不小于95%。甲硝唑-D3、地美硝唑-D3、羟基甲硝唑-D2、羟基地美硝唑-D3对照品：纯度不小于95%。乙酸乙酯（色谱纯），乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），盐酸（优级纯），正己烷（分析纯），氨水（分析纯），甲酸（色谱纯）。

1.2 溶液配制

1.2.1 盐酸溶液

盐酸溶液（0.1 mol/L）：取8.3 mL浓盐酸，加水稀释定容至1 000 mL，混匀。

1.2.2 标准储备液

标准储备液（1 000 μg/mL）：分别称取适量的甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑、羟基地美硝唑对照品，用甲醇溶解配制成1 000 μg/mL的标准储备液，-20 ℃冰箱中保存。

1.2.3 混合标准储备液

混合标准储备液（10 μg/mL）：分别准确量取0.1 mL甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑、羟基地美硝唑标准储备液至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，-20 ℃冰箱中保存。

1.2.4 混合标准工作液

取适量的10 μg/mL的混合标准储备液，用甲醇稀释成适宜浓度的标准工作液，-20 ℃冰箱中保存。

1.2.5 内标储备液

内标储备液（1 000 μg/mL）：分别称取适量的甲硝唑-D3、地美硝唑-D3、羟基甲硝唑-D2、羟基地美硝唑-D3对照品，用甲醇溶解配制成1 000 μg/mL的内标储备液，-20 ℃冰箱中保存。

1.2.6 混合内标储备液

混合内标储备液（10 μg/mL）：分别准确量取0.1 mL甲硝唑-D3、地美硝唑-D3、羟基甲硝唑-D2、羟基地美硝唑-D3内标储备液至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，-20 ℃冰箱中保存。

1.2.7 混合内标工作液

混合内标工作液（0.1 μg/mL）：准确量取0.1 mL混合内标储备液（10 μg/mL）至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，-20 ℃冰箱中保存。

1.3 仪器及设备

液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源），天平（感量0.01 g和0.00001 g），高速冷冻离心机，涡旋混合器，固相萃取装置，氮吹仪，滤膜（0.2 μm），MCX固相萃取柱（60 mg/3 mL）。

2 测定

2.1 样品前处理

称取（2.00±0.02）g牛奶试样于50 mL离心管中，添加100 μL 0.1 μg/mL内标工作液，涡动30 s混匀，静置10 min。加15 mL乙酸乙酯，涡动2 min，10 000 r/min离心5 min。上清液转移至另一50 mL离心管中，残渣用15 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并两次提取液，20 ℃水浴氮气吹干。加0.1 mol/L盐酸5 mL，涡动1 min充分溶解残渣，加5 mL正己烷，手摇20 次，5 000 r/min离心5 min，弃正己烷层。下层再加5 mL正己烷重复去脂一次，除尽正己烷层，备用。MCX固相萃取柱依次用2 mL甲醇和2 mL 0.1 mol/L盐酸活化，取备用液全部过柱，再依次用2 mL 0.1 mol/L盐酸、1 mL甲醇、1 mL 2%氨水淋洗，用2 mL甲醇-水-氨水（80%-15%-5%）洗脱。洗脱液20 ℃水浴氮气吹干，0.5 mL水涡动1 min复溶，过滤膜后供液相色谱-串联质谱仪测定。

2.2 液相色谱条件

色谱柱：C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）。

流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为0.1%甲酸乙腈溶液。

要实施环境影响评价法，就要加大对违法行为的处罚力度。对于施工时破坏环境的企业不仅要交罚金，还要让他们停止施工。对于排放污染物出现超标问题，要根据相关规定进行处罚，同时不审批环境影响评价。

流速：0.3 mL/min。

柱温：30 ℃。

进样量：10μL。

梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

表2 定性、定量离子及锥孔电压、碰撞能量

表3 硝基咪唑标准曲线回归方程及相关系数（R2值）

2.3 质谱条件

离子源：电喷雾离子源。

检测方式：多反应监测。

电离电压：3.0 kV。

源温：100 ℃。

雾化温度：350 ℃。

锥孔气流速：30 L/h。

雾化气流速：600 L/h。

定性、定量离子及对应的锥孔电压、碰撞能量见表2。

3 试验设计

3.1 标准曲线

制备一系列牛奶基质匹配标准溶液，浓度为0、2.0、4.0、20.0、40.0、200.0、400.0 μg/L，经液相色谱-串联质谱仪测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得出的回归方程及相关系数（R2值）见表3。

3.2 灵敏度

以3 倍信噪比为检测限，10 倍信噪比为定量限，该方法的检测限和定量限分别能达到0.5μg/kg和1.0 μg/kg。

3.3 准确度和精密度

将硝基咪唑标准溶液添加到不同空白牛奶中，使样品中硝基咪唑类药物浓度为定量限（1.0 μg/kg），按样品处理方法提取、净化，然后进行LC-MS/MS分析。批内进行5 个重复，批间进行3 批次试验。用内标法计算回收率，批内、批间变异系数见表4。

表4 牛奶中硝基咪唑类药物浓度定量限位1.0µg/kg添加的回收结果

4 结论

硝基咪唑在牛奶中的回收率为86.7%～89.2%，变异系数小于15%，试验结果表明，该方法能够达到灵敏度、准确度和精密度的要求。

2017-06-15）

贾涛，北京市饲料监察所，高级畜牧师，理化检验室检验员，质量监督员，从事饲料与生乳检测、调研及质量监督工作。