青海藏、汉族子痫前期患者与HLA-G基因 14 bp插入/缺失多态性 ※

裴青青，谢莹莺，赵海宁，杨娟，李琴，宋熲，马萌，肖海雪

(1.青海大学；2.青海大学附属医院)

青海藏、汉族子痫前期患者与HLA-G基因14 bp插入/缺失多态性※

裴青青1，谢莹莺2，赵海宁，杨娟，李琴，宋熲，马萌，肖海雪

(1.青海大学；2.青海大学附属医院)

目的探讨青海地区藏、汉民族子痫前期患者与HLA-G基因Exon8 14bp插入/缺失多态性的相关性。方法收集2015年4月到2016年10月间在青海大学附属医院产科藏、汉民族正常及子痫前期孕妇血标本348例，采用DNA提取、聚合酶联反应、琼脂糖电泳及测序等方法对四组HLA-G的14 bp位点的等位基因及基因型进行分型，比较各组间该位点的等位基因及基因型分布是否存在差异。结果各组间等位基因及基因型多态性分布差异均无统计学意义，而将基因型合并后发现该位点在汉族正常组及藏族正常组间分布存在差异，差异具有统计学意义。结论藏、汉族患者HLA-G基因Exon8 14 bp插入/缺失的多态性可能与子痫前期的发病无关，而与民族差异有关。

子痫前期 人类白细胞抗原G 基因多态性

人类白细胞抗原-G(Human Leukocyte Antigen，HLA-G)属于非经典HLA -Ⅰ类分子，是体内重要的抗免疫分子。妊娠过程较复杂，其成功有赖于母体对携带父方基因胎儿的免疫耐受，而HLA-G可诱导母胎介面的免疫逃逸，使胚胎逃避母体的免疫监视而在母体种植维持正常妊娠，即在妊娠过程中HLA-G适量表达与妊娠结局关系密切[1]。因此，HLA-G异常表达可能会改变母胎免疫耐受从而与病理妊娠相关，如子痫前期(Preeclampsia，PE)等[2]。我们前期研究显示，青海地区子痫前期发病率较高，子痫前期患者血清及胎盘组织中可溶性HLA-G及HLA-G mRNA水平明显低于正常产妇[3]，这表明在高原低氧环境下，HLA-G表达量降低与子痫前期的发生发展有关。藏、汉民族HLA-G基因型的差异性与子痫前期的易感性和疾病的发展是否存在相关性，本课题拟采用DNA提取、聚合酶联反应、琼脂糖电泳及测序等方法对四组HLA-G的位点的等位基因及基因型进行分型，比较各组间该位点的等位基因及基因型分布是否存在差异。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采集2015年4月到2016年10月间在青海大学附属医院产科分娩的藏、汉民族孕妇血标本348例。正常组孕周37～40 w，子痫前期组孕周34～40 w(子痫前期会引起病理性早产)。汉族正常妊娠妇女101例、子痫前期患者87例，藏族正常妊娠妇女108例、子痫前期患者52例。

四组间一般资料比较见表1，四组间年龄及孕妇体重差异均无统计学意义(P>0.05)，但四组间孕周及胎儿体重差异在正常组和同民族子痫前期组具有统计学意义(P<0.05)，即汉、藏族子痫前期组与汉、藏正常组之间孕周及胎儿体重差异具有统计学意义，而民族之间差异无统计学差异。

Table 1 Comparison of gravida clinical data in four groups(±s)

*：与同民族正常组比较，P<0.05.

1.2 检测方法

1.2.1 DNA提取

于入院第二日清晨6点空腹抽取孕妇肘静脉血3 mL置-20 ℃冰箱冻存；用德国QIADEN公司生产的全血人类基因组DNA提取试剂盒，按照说明提取人类基因组DNA，用NanoDrop 2000c分光光度计测量其含量及纯度(DNA样本OD260/OD280介于1.6～1.8之间、浓度约100ng/μL时为合格)。

1.2.2 PCR扩增及电泳

引物参照文献[4]，引物序列：F引物5′-GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACC-3′，R引物5′-GGAAGGAATGCAGTTCAGCATGA-3′。Exon8扩增过程如下：PCR反应体系为25 μL，2×Mix 12.5 μL，F引物0.5 μL，R引物0.5 μL，无DNA/RNA酶水10.5 μL，模板DNA 1 μL；反应条件：预变性94 ℃ 5分钟，变性 94 ℃ 30秒，退火64 ℃ 1分钟，延伸72 ℃ 2分钟，循环35次，再于72 ℃延伸10分钟；用4%的琼脂糖电泳(U=100v，Ⅰ=90mA，T=3.5h，胶长度为12cm，上样量为5μL)检测PCR产物，利用D2000 DNA Mark比对，将部分PCR原液纯化送上海美吉生物公司测序。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 HLA-G基因Exon8 PCR扩增产物电泳结果

部分样品PCR扩增后经4%琼脂糖电泳后结果见图1：若有一条210 bp大小的条带则基因型为210 bp/210 bp(DD)，224 bp为224 bp/224 bp(Ⅱ)，两条均有则为210bp/224bp(ID)。

图1HLA-G基因Exon8PCR产物凝胶电泳图

Figure1GelelectrophoresisofHLA-GgeneExon8PCRproducts

2.2 测序结果

经过GenBank Blast比对，与HLA-G Exon8片段相符，224 bp产物比210 bp产物多了一段长度为14 bp的基因序列：ATTTGTTCATGCCT，这与文献[5]报道的一致，测序峰图见图2。

图2HLA-GExon8PCR产物测序峰图

Figure2SequencingpeakmapofHLA-GExon8PCRproduct

2.3 Hardy -Weinberg平衡检测结果

汉族正常组、子痫前期组，藏族正常组及子痫前期组四组基因型分布用Finetti软件分析后所得理论频数及P值见表2。表2显示，P值均>0.05，说明四组的基因型分布均符合Hardy -Weinberg平衡。

表2 HLA-G基因14 bp插入/缺失多态性Hardy -Weinberg平衡检测结果

Table 2 Hardy -Weinberg balance test in HLA-G 14bp insertion / deletion polymorphism

2.4 HLA-G 基因Exon8 14 bp插入/缺失多态性分析结果

HLA-G14 bp插入/缺失多态性的等位基因频率、基因型频率分布四组间比较均无统计学差异(P>0.05)，汉族正常组及藏族正常组间II基因型、DD/ID基因型分布具有统计学差异(P<0.05)，见表3～5。

表3 HLA-G基因14 bp插入/缺失多态性基因型比较结果(%)

Comparison of Genotype in HLA-G gene 14 bp insertion/deletion polymorphism

表4 HLA-G基因14 bp插入/缺失基因型比较结果(基因型合并后，%)

Table 4 Comparison of Genotype in HLA-G gene 14 bp insertion/deletion polymorphism(after combining with genotypes)

*：藏族正常妊娠组与汉族正常妊娠组比较，χ2=7.259，P=0.007.

表5 HLA-G基因14 bp插入/缺失多态性等位基因比较结果(%)

Table 5 Comparison of alleles in HLA-G gene 14 bp inserti-on / deletion polymorphism

3 讨论

3.1 妊娠期高血压疾病中最常见的种类即是子痫前期，病因可能有子宫螺旋小动脉重筑不足、炎症免疫过分刺激、血管内皮损伤及遗传因素等。HLA-G生物学特点可能与HLA-G的3′-UTR构造特点有关，14 bp插入/缺失位点紧邻富含AU的区域，预测14 bp插入/缺失多态性通过影响HLA-G mRNA构造的稳定不变性来影响HLA-GmRNA和HLA-G蛋白水平[6]。也有研究提示，可能通过影响转录调控因子的亲和能力，来影响HLA-G的表达水平[7]。

3.2 目前有关HLA-G Exon8 14 bp插入/缺失多态性对子痫前期存在何种影响结论不一。单一从母亲HLA-G基因研究认为，HLA-G14 bp基因多态性与PE的相关性不大[8]，但也有研究表明14 bp缺失多态性的存在可减低母亲重度子痫前期的发病风险[9]。国内学者通过联合研究母亲、父亲及胎儿的HLA-G14 bp基因型与子痫前期的关系，发现父亲与胎儿的14 bp插入多态性是子痫前期的危险因素，而胎儿的14 bp缺失多态性则为该病的保护性因素[10]；也有学者发现母/儿均是缺失纯合子基因型可能是重度子痫前期发生的抗性因子[11]。

3.3 本研究四组间HLA-G14 bp插入/缺失的等位基因及基因型分布差异无统计学差异(P>0.05)，即该位点对子痫前期的发病意义不大，与国内外部分研究一致[12]。将DD和ID两类基因型合并后和II基因型比较后提示，汉族正常妊娠组及藏族正常妊娠组分布差异具有统计学意义(P<0.05)，表明该位点基因型在两组间的构成比不同，该位点多态性存在民族差异。由于藏族子痫前期组病例数不足，因此HLA-G14 bp多态性是否参与子痫前期疾病的发生，有待后期加大样本量进行进一步的研究。

由于子痫前期可能受多基因遗传影响，是携带一半父亲基因的胎儿与母亲之间的不恰当免疫的结果，且HLA-G邻近基因位点之间存在一定的连锁不平衡，所以下一步我们将从多基因联合、该基因多位点联合及双亲胎儿三者联合等多方面研究子痫前期的发病原因，为子痫前期的研究提供新的思路及方法。

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AstudyontherelationshipbetweenPreeclampsiaandthepolymorphismofHLA-G14bpinsertion/deletioninTibetanandHannationalityofQinghaiprovince

PEI Qing-qing，XIE Ying-ying，ZHAO Hai-ning，et al.

(1.Qinghai University；2.Affiliated Hospital of Qinghai University)

ObjectiveTo study the relationship between Preeclampsia(PE)and polymorphism of HLA-G exon8 14 bp insertion/deletion in Han and Tibetan nationality of Qinghai province.MethodsCollect 348 blood samples of normal and PE pregnancies，of which delivered at Affiliated Hospital of Qinghai Univernity.Detect allele and genotype of HLA-G Exon 8 14 bp insertion/deletion by DNA extraction，polymerise chain reaction，agarose electroptohoresis and sequencing among the four groups，and compare whether there is difference in the distributions of allele and genotype located at the site of gene among the groups.ResultsThere was no significant difference among the four groups in distributions of allele and genotype，however，combine with genotypes we found that there was a statistical significance in control group of Han and Tibetan nationality.ConclusionThe polymorphism of the HLA-G gene Exon8 14 bp insertion / deletion in Tibetan and Han patients may not be related to the incidence of preeclampsia and is related to ethnic differences.

Preeclampsia HLA-G Gene Polymorphism

R363.1

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.03.005

2017-01-09

※：青海省(应用)基础研究计划项目(2013-Z-736)；◎：通信作者，硕士研究生，主任医师，邮箱：xyy09001@163.com 裴青青(1990～)，女，汉族，山西籍，青海大学研究生院硕士研究生