β2肾上腺素受体基因在Sf9细胞中的表达及纯化

王 健，刘 媛，张俊花，韩正政，兰凤英

β2肾上腺素受体基因在Sf9细胞中的表达及纯化

王 健1,2，刘 媛1，张俊花1，韩正政1，兰凤英1

（1.河北北方学院农林科技学院，河北 张家口 075000；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业部农产品质量安全重点实验室，北京 100081）

通过密码子优化、昆虫杆状病毒表达系统（Bac-to-Bac）构建、表达条件筛选及镍柱亲和层析，研究β2肾上腺素受体（β2adrenergic receptor，β2AR）基因（β2AR）在昆虫细胞Sf9中的高效表达及纯化策略。方法：人工合成改造后的β2AR基因，将其克隆至转移载体pFastBac1中，构建重组杆状病毒表达质粒pFastBac1-β2AR’，转染昆虫细胞Sf9，优化表达条件，采用镍离子亲和层析法纯化重组蛋白并进行活性鉴定。结果：适宜的表达条件为感染细胞使用的感染复数5、感染后表达时间48 h，Western blot分析显示在47 kD左右处出现清晰的特异性条带，与预期结果一致。纯化的受体蛋白纯度大于90%，活性鉴定结果显示该受体蛋白可特异性吸附盐酸克伦特罗、沙丁胺醇及莱克多 巴胺3 种β激动剂的酶标记物，OD值分别为0.983、0.947和0.91 2。结论：本研究实现了β2AR受体在Sf9细胞中的表达，且纯化后的受体蛋白保持了较好的β激动剂亲和活性，为利用β2AR受体开展β激动剂多残留快速检测技术提供了依据。

β2肾上腺素受体；杆状病毒表达载体；Sf9细胞；表达；纯化

目前，β激动剂（俗称“瘦肉精”）的违禁添加仍然是影响我国畜产品安全及养殖业健康发展的热点问题之一。特别是多种β激动剂的混合使用及新型结构类似物的层出不穷，充分暴露出了现行检测技术对该类违禁物的多残留高通量分析及未知物筛查存在严重不足。

现有针对β激动剂检测的标准方法及研究报道主要分为确证检测技术和快速检测技术两大类。确证分析方法常见的有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）[1]、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[2-3]、液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[4-5]和四极杆-飞行时间质谱（quadrupole-time of flight，Q-TOF）[6-7]等，但其均存在着仪器设备昂贵、操作步骤复杂等固有缺点。近年来快速检测方法顺应市场需要和监管需求异军突起，将传统的抗原抗体识别体系与新兴的材料或信号放大机制相结合形成了多种方法，如酶联免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）[8-9]、胶体金免疫层析[10-11]、电化学[12-13]、量子点[14]和传感器[15]等，但它们往往只能检测有限的特定目标物，使用范围仍有很大的局限性。

基于受体的快速检测方法是利用受体与配体间的特异性吸附，从而完成具有相同生物学效应的一类目标物的类特异性测定，可实现对β激动剂类违禁物的多残留检测和非目标物分析。β2肾上腺素受体（β2adrenergic receptor，β2AR）是构建β激动剂受体检测方法的关键识别元件，鉴于天然β2AR在生物体内的极低丰度和分离难度，近些年体外表达已成为获得该受体的主流方法[16]。β2AR是具有7次跨膜α螺旋结构的膜蛋白[17]，影响其用于检测方法研发的难点主要集中在重组β2AR受体的数量、活性及纯度等方面。国内外已有研究报道表明，通过大肠杆菌[18]、酵母[19]、昆虫细胞[20]、哺乳动物细胞[21]以及无细胞表达系统[22]均可在体外制备具有β激动剂亲和活性的蛋白，但表达水平和活性强弱因宿主细胞不同而呈现出较大差异[23]。其中杆状病毒感染的昆虫细胞草地贪叶蛾（Spodoptera frugierda）卵巢细胞Sf9是β2AR受体最为有效的体外表达体系之一，重组蛋白不仅产量高，而且具有与哺乳动物细胞相近的蛋白活性。但国内相关报道极少，仅见Cheng Guyue等[24]利用该表达体系对野生型β2AR基因进行了表达和纯化。由于β2AR基因中存在着不适于昆虫细胞表达的稀有密码子，影响了表达效果，因此本研究拟先对野生型β2AR基因改造后再进行表达尝试，以求实现β2AR的高效表达。

本研究首先对前期克隆得到的猪β2AR基因进行改造，然后将其与转移载体pFastBac1连接，构建重组杆状病毒表达质粒并转染Sf9细胞，优化得到适宜的感染细胞感染复数（multiplicity of infection，MOI）和表达时间，采用Ni2+亲和层析法纯化重组蛋白并进行ELISA活性分析，以期为建立基于重组受体的β激动剂多残留快速检测方法提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪β2AR基因重组克隆质粒pMD-18T-β2AR由笔者前期构建及所在实验室保存；Sf9细胞 中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统（主要包括转移载体pFastBacTM1、大肠杆菌（Escherichia coli）DH10 BacTM菌株、E. coli DH5α和转染试剂Cellfectin） 美国Invitrogen公司；T4连接酶 宝生物工程（大连）有限公司；质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒 美国Axygen公司；限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ 美国NEB公司；昆虫细胞无血清培养基SF 900ⅡSFM 美国Hyclone公司；辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记的羊抗鼠二抗 美国Sigma公司；His鼠源单克隆抗体、Ni-NTA树脂 美国Qiagen公司。

1.2 仪器与设备

9902型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Applied Biosystems公司；Imaging G3凝胶成像仪 北京昊诺斯科技有限公司；Power Pac 300型DNA电泳仪、Powerpac Universal蛋白电泳仪 美国Bio-Rad公司；Multiskan MK3酶标仪 美国Thermo公司；AKTA explorer蛋白纯化系统 美国GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 β2AR基因序列的改造与合成

利用Protparam工具（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）对已克隆得到的猪β2AR基因（GenBank登录号：KF023571.1）对应的氨基酸序列进行理化特性分析，依据昆虫细胞密码子的偏好性对其进行改造，使其适应昆虫细胞表达系统。分别在改造后基因的5’端和3’端引入限制性内切酶EcoRⅠ位点和限制性内切酶XbaⅠ位点，改造后基因由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.2 重组杆状病毒表达质粒的构建与鉴定

将上述合成的β2AR改造基因与转移载体pFastBac1分别用EcoRⅠ和XbaⅠ进行双酶切，然后琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的片段和载体片段，经T4 DNA连接酶16 ℃条件下连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取Amp阳性单菌落并提取质粒，用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定，将初步鉴定为阳性的重组质粒送上海博亚生物技术有限公司测序，验证读码框的正确性，序列正确的重组质粒命名为pFastBac1-β2AR′。

1.3.3 重组杆状病毒表达质粒转染Sf9细胞

Sf9细胞的培养：选择无血清培养基SF 900ⅡSFM，27 ℃孵育，无需CO2，采用半贴壁培养方式，3～4 d传代一次。在6 孔细胞培养板中，将9×105个处于对数生长期的Sf9细胞接种于每孔含有2 mL培养基的平板中，27 ℃培养箱中培养2 h。采用Cellfectin试剂以脂质体法将鉴定正确的pFastBac1-β2AR’质粒转染Sf9细胞，具体步骤参考Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书进行。在27 ℃潮湿条件下孵育72 h左右，在倒置显微镜下观察，直到细胞发生典型病毒感染的病变，从培养基中收获细胞制备P1代重组病毒株。测定P1病毒株的滴度，并扩增得到滴度更高的P2病毒株，测定滴度后同法扩增得到P3病毒株，用于重组蛋白表达。

1.3.4 表达条件的优化及鉴定

大量因素影响着重组蛋白的最优表达，本实验主要对MOI和感染后表达时间两个关键因素进行了优化。首先，用鉴定正确的重组杆状病毒质粒进行小量表达尝试，筛选能够特异表达的病毒株。然后将其扩增得到的P3病毒株进行表达条件的优化研究，具体方法如下：在24孔细胞板中，以6×105个/孔接种Sf9细胞，接触至少30 min；弃去培养基，用新鲜的培养基清洗一次，换上300 μL新鲜培养基；按照MOI值1、5、10将重组毒株分别感染Sf9细胞，在27 ℃培养箱中培养。对应每个MOI值分别在48 h和72 h感染后收获细胞，用细胞裂解液（含终浓度为1 mmol/L的苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）裂解后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和Western blot检测，阴性对照为正常Sf9昆虫细胞裂解物。

1.3.5 重组受体蛋白的纯化

采用固定有镍离子的亲和色谱柱对带有His标签的重组蛋白进行蛋白纯化。以Ni-NTA树脂为填料，对适宜表达条件下获得的细胞裂解产物进行纯化，主要步骤为：1）柱平衡：以1 mL/min的流速用10 CV的Lysis buffer平衡色谱柱。2）上样纯化：将细胞裂解液过柱，流速为1 mL/min。3）漂洗：连续用结合缓冲液PBS、含有30 mmol/L咪唑的PBS及含有50 mmol/L咪唑的PBS各5～10 CV漂洗柱子，流速为1 mL/min。4）洗脱：用含有250 mmol/L咪唑的PBS以1 mL/min的流速洗脱色谱柱。最后取适量纯化蛋白进行Western blot和活性鉴定。

1.3.6 纯化蛋白的Western blot及活性鉴定

以正常Sf9昆虫细胞裂解物为阴性对照，采用His鼠源单克隆抗体对获得的纯化蛋白样品进行Western blot鉴定。参考笔者前期优化的ELISA方法[25-26]，测定该纯化受体蛋白对盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇3 种β激动剂HRP酶标记物的特异性结合程度，对其进行活性鉴定。

2 结果与分析

2.1 改造后β2AR基因序列的分析与鉴定

根据β2AR的氨基酸组成，考虑昆虫细胞的偏好性，进行密码子优化，并在编码核苷酸序列的5’端添加了6×His标签的核苷酸序列，改造后的β2AR基因及其氨基酸序列如图1所示，与野生型β2AR不同的基因用下划线标示，受体结合部位的氨基酸用圆圈标示。1%琼脂糖凝胶电泳分析结果与理论设计一致，表明已获得目的基因。

图1 改造后的β2AARR基因序列及其编码的氨基酸序列Fig. 1 Modifi ed gene and amino acid sequence of β2AR

2.2 重组杆状病毒表达质粒的鉴定

用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ对重组杆状病毒表达质粒进行双酶切鉴定，结果如图2所示，在4.8 kb和1.3 kb左右分别出现了pFastBac1载体条带和目的基因条带，与预期大小相符，将双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序，测序结果与基因合成报告完全一致，将该重组质粒命名为pFastBac1-β2AR’。

图2 重组杆状病毒质粒的双酶切鉴定Fig. 2 Identifi cation of recombinant plasmid by double restriction enzyme digestion

2.3 重组杆状病毒的鉴定及转染后的细胞病变

采用病毒空斑试验测定病毒滴度，结果显示P1病毒株滴度为2×106PFU/mL，P2病毒株滴度为1×107PFU/mL。用重组杆状病毒质粒转染Sf9细胞，27 ℃潮湿条件下孵育，观察细胞形态变化：转染后24 h，细胞直径逐渐增大且变圆；转染后24～72 h，细胞停止增长，细胞核显著增大；转染后72 h，细胞内颗粒状物增多，部分贴壁细胞脱落甚至消亡（图3）；以上细胞形态学变化证明重组杆状病毒质粒成功转染Sf9细胞。

图3 正常Sf9细胞（a）及转染后72 h Sf9细胞（b）显微镜图（×400）Fig. 3 Normal Sf9 cells and Sf9 cells at 72 h post transfection (× 400)

2.4 表达条件的优化及产物鉴定

挑选两个鉴定正确的重组杆粒在6 孔细胞板中转染Sf9细胞，每个杆粒转染2 个孔，表达测试结果如图4、5所示。SDS-PAGE结果（图4）显示，由于检测灵敏度等原因从图中无法清晰地看到目的蛋白条带。Western blot进一步分析（图5）得知，与正常的Sf9细胞相比，两重组杆粒均在47 kD左右处出现了单一的特异性反应条带，与预期结果一致，且2#杆粒表达产物（3、4泳道）条带更加清晰，因此选择2#杆粒扩增得到的P3病毒株进行表达条件优化试验。由图6可知，第2泳道的蛋白条带最为清晰浓重，因此筛选获得的适宜表达条件为：MOI值5、感染后表达时间48 h。

图4 Sf9细胞表达产物的SDS-PAGE结果Fig. 4 SDS-PAGE analysis of expression product from Sf9 cells

图5 Sf9细胞表达产物的Western blot结果Fig. 5 Western blot analysis of expression product on Sf9 cells

图6 表达条件优化的Western blot鉴定Fig. 6 Western blot analysis under the optimized expression conditions

2.5 纯化蛋白的Western blot鉴定

采用镍离子亲和层析法对带有His标签的重组蛋白进行纯化，结果如图7所示，过柱后的洗涤液在47 kD左右出现特异性条带，但同时伴随着弥散性杂蛋白，说明在洗涤过程中有部分目的蛋白被洗脱。洗脱液E1和E2出现了较为清晰的目的条带，且几乎无杂蛋白污染，纯度大于90%，将其收集后进行活性鉴定。

图7 表达条件优化的Western blot鉴定结果Fig. 7 Western blot analysis of the purifi ed protein

2.6 纯化蛋白的活性鉴定

以正常的Sf9细胞裂解蛋白为对照，按照已优化的ELISA方法对纯化蛋白进行活性鉴定，结果如表1所示，纯化得到的受体蛋白与盐酸克伦特罗、沙丁胺醇及莱克多巴胺3 种β激动剂的酶标记物均能够特异性吸附，OD值分别为0.983、0.947和0.912，表明纯化后的重组受体蛋白仍然保持了特异性识别β激动剂的生物活性。

表1 纯化蛋白ELISA测定结果Table 1 Determination of the purifi ed protein by ELISA

3 讨 论

提高β2AR表达效果的策略有很多，如密码子优化、将疏水氨基酸突变为亲水氨基酸、增加表达基因中的GC含量、摸索适宜的表达条件、不同蛋白标签的作用和有效终止子的使用等[27]。此外，定点突变也用于提高β2AR的表达水平和活性。如Warne等[28]在Sf9细胞中表达了截短的火鸡β2AR，其去除了N端的糖基化位点，并将116位的半胱氨酸突变为亮氨酸，达到了每升培养基生产0.5 mg粗蛋白的较高表达水平。本研究所采用的方法是将野生型β2AR基因按照昆虫细胞的密码子偏好性进行优化，使其更适合于昆虫细胞表达系统，同时在C端增加了组氨酸标签，这些操作均在一定程度上提高了蛋白表达水平，接近了每升毫克数量级的表达量，同时组氨酸标签的添加也为后续的纯化操作提供了便利。

昆虫杆状病毒表达系统（Bac-to-Bac）具有人们所普遍接受的一些优点[29]：可进行转录翻译后的加工修饰，使重组蛋白的生物活性接近天然蛋白；表达水平高，可同时表达多个外源基因；克隆容量大，能插入10 kb左右的外源基因；生物安全性好，在自然条件下杆状病毒对脊椎动物无致病性，也不能在脊椎动物细胞中复制表达和融合，是遗传学上最为安全的表达载体。基于以上原因，该表达系统是一种非常理想的真核表达系统。由于昆虫杆状病毒表达系统在产量和生物活性方面的良好表现，因此它也是目前国内外用于G蛋白偶联受体（GPCRs）类膜蛋白体外表达最为常用的表达系统。本研究对影响表达水平最为显著的两个因素进行了优化，得到感染细胞使用的MOI最适为5，表明MOI过高或过低时均会对杆状病毒的生长产生抑制效应。适宜的表达时间为感染后48 h，与Cheng Guyue等[24]所得的结果相同。

膜蛋白的纯化一直以来都被认为具有极大的挑战性，β2AR受体具有GPCRs共有的7 次跨膜α螺旋结构，纯化时面临着蛋白生物活性丧失和回收率不高等难题。本研究依据重组蛋白上添加的6×His标签，采用近年来普遍使用的膜蛋白纯化方法Ni2+亲和层析法，并对纯化蛋白进行了Western blot检测和直接ELISA活性鉴定。经典的受体活性鉴定方法多采用以125I-CYP为放射性配基的检测法，尽管灵敏性较高，但放射性配基价格昂贵，实验条件复杂，且对操作人员健康影响较大。因此，本实验选择由王迪[30]采用的ELISA活性鉴定方法，不仅简便安全，而且为后续建立基于受体的非放射性快速分析方法进行了初步探索。

4 结 论

本研究利用昆虫杆状病毒表达系统在Sf9细胞中成功表达了密码子优化后的β2AR基因，筛选得到的适宜表达条件为：感染细胞使用的MOI值5、感染后表达时间48 h。Western blot分析可知在47 kD左右出现单一清晰的特异性条带，与目的蛋白分子质量大小一致。纯化后所得受体蛋白纯度大于90%，ELISA活性鉴定结果表明该受体蛋白对盐酸克伦特罗、沙丁胺醇及莱克多巴胺3 种β激动剂的酶标记物均呈特异性吸附，OD值依次为0.983、0.947和0.912。本实验为β2AR活性蛋白的大量制备及建立基于该受体的β激动剂快速检测方法提供了科学依据。

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Expression and Purifi cation of β2Adren ergic Receptor in Sf9 Cells

WANG Jian1,2, LIU Yuan1, ZHANG Junhua1, HAN Zhengzheng1, LAN Fengying1
(1. College of Agriculture and Forestry, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China;2. Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products of CAAS, Key Laboratory of Agrifood Safety and Quality,Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China)

Codon optimization, construction of recombinant baculovirus system (Bac-to-Bac), screening of optimal expression conditions and Ni-chelating affi nity chromatography were used to develop an effi cient strategy for the expression and purifi cation of β2adrenergic receptor（β2AR）gene in Sf9 cells. The modifi ed β2AR gene was artifi cially synthesized and cloned to the transfer vector pFastBac1 to construct the recombinant baculovirus expression plasmid pFastBac1-β2AR′.Then Sf9 cells were transfected with the recombinant plasmid. The expression conditions were optimized. The expression product was purifi ed by Ni-NTA-affi nity chromatography and its ligand binding affi nity was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results showed that the optimal expression conditions were as follows: multiplicity of infection (MOI) of the infected ce lls, 5; and expression time, 48 h. In the Western blot analysis, a single band with an apparent molecular mass of 47 kD appeared as expected. After purifi cation, the recombinant protein was more than 90%pure. The ligand binding assay indicated that it could specifi cally bind to all three horseradish peroxidase (HRP)-β-agonists:clenbuterol, salbutamol, ractopamine, and the OD values obtained from ELISA were 0.983, 0.947 and 0.912, respectively.In this paper, the effi cient expression of β2AR in Sf9 cells was accomplished. Furthermore, the purifi ed receptor protein remained better binding affinity to β-agonists, laying a foundation for developing a rapid multi-residue assay for the determination of β-agonists with β2AR.

β2adrenergic receptor; baculovirus expression vector; Sf9 cells; expression; purifi cation

10.7506/spkx1002-6630-201720006

TS201.6

A

1002-6630（2017）20-0034-06

王健, 刘媛, 张俊花, 等. β2肾上腺素受体基因在Sf9细胞中的表达及纯化[J]. 食品科学, 2017, 38(20): 34-39. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720006. http://www.spkx.net.cn

WANG Jian, LIU Yuan, ZHANG Junhua, et al. Expression and purifi cation of β2adrenergic receptor in Sf9 cells[J]. Food Science,2017, 38(20)∶ 34-39. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720006. http∶//www.spkx.net.cn

2016-09-24

河北北方学院博士启动基金项目（201706）；公益性行业（农业）科研专项（201203094）

王健（1980—），男，副教授，博士，研究方向为食品安全快速检测技术。E-mail：xuanyuanjian0228@126.com