新鲜仙人掌多糖的提取及其抗氧化活性研究

虞旦，谢娅霏，苏宁，安全，赵丹，王昌涛，李萌，*

（1.北京工商大学理学院，北京100048；2.中国检验检疫科学研究院化妆品技术中心，北京100176；3.云南白药集团公司，云南昆明650500）

新鲜仙人掌多糖的提取及其抗氧化活性研究

虞旦1，谢娅霏1，苏宁2，安全3，赵丹1，王昌涛1，李萌1，*

（1.北京工商大学理学院，北京100048；2.中国检验检疫科学研究院化妆品技术中心，北京100176；3.云南白药集团公司，云南昆明650500）

对新鲜仙人掌提取多糖最优工艺及其抗氧化效果进行研究。在单因素试验的基础上采用响应面法RSM对热水浸提新鲜仙人掌多糖提取条件进行优化，优化后的工艺为：温度64.25℃，时间1.5 h，液料比22.38∶1（mL/g），提取率高达（0.114 2±0.027 3）%，多糖纯度为（37.686±9.009）μg/mL。利用体外实验模型评价其抗氧化性，结果表明该提取液对3种自由基有一定的清除能力，且呈剂量相关性，浓度分别为5.58、10.04、8.78 mg/mL的提取液可清除50%的DPPH自由基、羟自由基和ABTS+自由基。

仙人掌多糖；热水浸提；抗氧化性；响应面分析

Abstract：The extraction conditions ofO.dilleniipolysaccharide with a series of methods were examined.On the basis of one factor tests，the response surface methodology was used to optimize the boiling water extraction ofO.dilleniipolysaccharides.Design expert analysis indicated that the optimal processing conditions were：temperature 64.25 ℃，time 1.5 h，liquid to solid ratio 22.38 ∶1（mL/g），under these conditions，the extraction yield ofO.dilleniipolysaccharides was （0.114 2±0.027 3）%and mass concentration was （37.686±9.009）μg/mL.Vitro experimental model was used to evaluate the antioxidant activities，the results showed that the extracting liquid of theO.dilleniihad the capacity to scavenge three kind of free radical and scavenging activity was increased with the polysaccharide concentration.The extracting liquor with 5.58，10.04，8.78 mg/mL concentration of extracting liquor ofO.dilleniicould eliminate 50%DPPH free radical，hydroxyl radicals and ABTS+free radical．

Key words：O.dillenii polysaccharide；boiling water extraction；antioxidant capacity；response surface methodology（RSM）

仙人掌（Opuntia dilleniiHaw.），是石竹目仙人掌科（Cactaceae）的植物总称，别名仙人扇、霸王树、观音掌、仙巴掌、火掌等，常生长于沙漠及半沙漠等干燥少雨环境中，大小及形态多样，属于多肉植物。

仙人掌多糖（Opuntia dilleniiPolysaccharides，ODP）是仙人掌主要生物活性成分之一，主要提取自仙人掌的茎和果实，主要由极性大分子化合物葡萄糖、阿拉伯糖和鼠李糖等组成，活性较高，能够降血糖血脂、抗氧化、抑菌和保湿。多糖不溶于乙醇，易溶于水，现在已有的研究中对多糖的提取常用的方法有水提、酸提、碱提、苯酚提取、超声辅助提取、微波辅助提取和酶提取等方法[1]。多糖的生物学功能众多，临床作用广泛，尤其是在美容方面，据研究，仙人掌多糖有保湿、稳定、改善肤色、抗衰老、抗菌等功能[2-5]，因而可作为美容食品和化妆品的有效成分。且高分子多糖无毒副作用，与常用化妆品成分配伍性好，作为功效型化妆品添加剂将有着广阔的前景[6]。

目前，如何高效、高纯度、低成本地从中提取仙人掌多糖是研究的重点。由于过酸、过碱或温度物理条件过极端都会一定程度上破坏仙人掌多糖的结构，所以在本课题中，选用了热水浸提法，将更有利于多糖结构的保护[7]，此外，新鲜仙人掌肥厚的肉质茎内含有丰富的矿物质、纤维素、SOD（Superoxide Dismutase，超氧化物歧化酶）和黄酮类等多种活性功能成分[8]，为更好地保留这些活性物质，所以本试验用的是新鲜的去皮仙人掌进行热提，提取率基数是新鲜仙人掌重量，区别于其他文献中将仙人掌烘干成干粉再提取。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用生长期为3～8个月的新鲜仙人掌：云南白药集团公司（这个生长期内的仙人掌富含仙人掌多糖ODP），未去皮原材料平均称重约 130g/块～200g/块；葡萄糖、苯酚、硫酸、高氯酸、冰醋酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、酒石酸钾钠、硫酸铜、福林酚（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；水（过滤超纯水）：由北京工商大学理学院实验室制备。

1.2 仪器与设备

BS2202S型电子天平、A2492型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；DQHZ-2001A大容量全温度振荡培养箱：江苏省太仓市华美生化仪器厂；HH-2电热恒温水浴锅：北京长安科学仪器厂；DSHZ-300恒温水浴振荡器：江苏省太仓市实验设备厂；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；YZB-苏（锡）1132-2004低速大容量多管离心机：无锡市瑞江分析仪器有限公司；HR2195搅拌机匀浆机：飞利浦有限公司。

1.3 方法

1.3.1 仙人掌多糖ODP含量测定

标准曲线的绘制，参照苯酚硫酸法[9]，经测定，在0～120 μg/mL浓度范围内吸光度A490对多糖浓度进行线性回归，标准曲线为：y=0.015 1x+0.004 2，R2=0.999 6，x为多糖浓度，μg/mL；y为吸光度值。

水溶性ODP样品含量测定：准确吸取样品1 mL置于试管中，吸取0.5 mL 5%苯酚于试管，摇匀待其充分反应，再加入2.5 mL浓H2SO4，盖上试管盖，充分摇匀，并静置5 min；将反应后的试剂沸水浴1 h，取出在490 nm处测定吸光值A。

1.3.2 仙人掌热水浸提法单因素试验[10-12]

1.3.2.1 时间单因素试验

选取 1、2、3、4、5 h 这 5 个时间梯度作时间的单因素探究试验条件，固定液料比为20∶1（mL/g），提取温度为70℃，提取pH值为7，取上层离心液6.6 mL，定溶于10 mL的容量瓶，测定多糖含量。设置3组平行。

1.3.2.2 温度单因素试验

选取 50、60、70、80、90 ℃这 5 个温度梯度作温度的单因素探究试验条件，固定液料比为20∶1（mL/g），提取时间为3 h（因为3 h时的提取率更高一些），提取pH值为7，取上层离心液6.6 mL，定溶于10 mL的容量瓶，测定多糖含量。设置3组平行。

1.3.2.3 液料比单因素试验

选取液料比 5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）这6个梯度作液料比的单因素探究试验条件，为保持与除单因素之外的大部分试验条件相同，固定提取温度为70℃，提取时间为3 h，提取pH值为7，取上层一定量离心液，使其稀释倍数保持30倍，将溶液定溶于10 mL的容量瓶，测定多糖含量。设置3组平行。

1.3.2.4 pH单因素试验

选取 pH 值为 3、4、5、6、7、8、9、10 这 8 个梯度作pH值的单因素探究试验条件，为保持与除单因素之外的大部分试验条件相同，固定液料比为20∶1（mL/g），提取时间为3 h，提取温度为70℃，取上层离心液6.6 mL，定溶于10 mL的容量瓶，测定多糖含量。设置3组平行。

1.3.3 仙人掌热水浸提法响应面试验[13-16]

在单因素试验的基础上，选取对试验结果影响较大的几个因素进行响应面试验设计（RSM），按照设计表格（见表1）进行试验，并测定多糖含量。

表1 响应面RSM试验因素水平表Table 1 Factors and levels for RSM experimental design

1.3.4 粗提ODP的制备[17-18]

采用响应面试验所得的最优试验方法进行多糖的提取，加入4倍体积的无水乙醇，冰箱冷藏24 h，次日于离心机3 000 r/min离心20 min，取沉淀，冷冻干燥，条件为-80℃，3 Pa，48 h。得到仙人掌粗多糖，再配置相当浓度的样品液用于抗氧化性分析。

1.3.5 粗提ODP的抗氧化活性

将粗提仙人掌多糖配制不同浓度的ODP溶液，对不同浓度ODP溶液分别进行DPPH自由基、ABTS+自由基和羟自由基清除率试验，同时计算半抑制浓度IC50。

1.3.5.1 DPPH自由基清除试验[19]

取等体积（一般为3mL）的待测液与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀（1号管）；取等体积的水与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀（2号管）；取等体积的无水乙醇与待测液混匀（3号管）。反应30 min后，在517 nm处测1，2和3号管的吸光度值，分别记为 A1，A2和 A3。DPPH 自由基清除率/%=（A0+A2-A1）/A0×100。

1.3.5.2 羟自由基清除试验[20]

取0.5 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中，依次加入1 mL 0.15 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.40）和 0.5 mL蒸馏水，充分混匀后，加入0.5 mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液，混匀后，加入0.5 mL 0.01%双氧水，于37℃水浴60 min后，在536 nm测其吸光值，所得数据为损伤管吸光度A损伤。未损伤管以0.5 mL蒸馏水代替损伤管中的0.5 mL 0.01%双氧水，操作方法同损伤管，测得未损伤管的吸光度值A未损伤。样品管以0.5 mL样品代替损伤管中的0.5 mL蒸馏水，操作方法同损伤管，测得样品管中的吸光度A样品。羟自由基清除率/%=（A样品-A损伤）/（A未损伤-A损伤）×100

1.3.5.3 ABTS+自由基清除试验[21]

将 5 mL 7 mmol/L ABTS+和 88 μL 140 mmol/L 过硫酸钾溶液混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS+储备液。使用前用无水乙醇稀释成工作液，使其在734 nm下的吸光度在0.70±0.02。在一系列比色管中，分别加入4 mL ABTS+工作液，再分别加入40 μL不同浓度的Trolox标准品溶液，准确振荡30 s，测定反应6 min后734 nm波长下的吸光度。绘制吸光度与Trolox标准品溶液浓度的标准曲线。取4 mL的ABTS+工作液置于试管中，加入40 μL样品待测液，准确振荡30 s，6 min后测定在734 nm下的吸光度，取3个平行取平均值，记为 A。ABTS+自由基清除率/%=（1-A/0.700）×100。

2 结果与分析

2.1 4种单因素对仙人掌热水浸提法的影响

2.1.1 时间对提取率的影响

按照方法1.3.2.1探究不同提取时间条件对ODP的提取率的影响，结果见图1。

图1 提取时间对ODP提取率的影响Fig.1 Effect of time on the polysaccharides content

如图1所示，提取率随着时间的增加而增加，到2h时达到了一个峰值0.162%，多糖浓度为53.46 μg/mL，随后提取率虽有略微提升，但变化率不明显，趋于平缓。可能是由于时间过长会使ODP本身结构分解导致提取率降低，本着工艺低成本和高提取率的原则，选择1.5、2、2.5 h作为响应面试验水平。

2.1.2 温度对提取率的影响

按照方法1.3.2.2探究不同提取温度条件对ODP的提取率的影响，结果见图2。

图2 提取温度对ODP提取率的影响Fig.2 Effect of temperature on the polysaccharides content

如图2所示，提取率随着温度的增加变化率显著，在温度为60℃时达到了峰值0.171%，多糖浓度为56.43 μg/mL，随后提取率随着温度的升高而降低，在80℃后变化开始趋于平缓。可能是一定温度下会促进ODP的溶出，过高温度会破坏本身结构导致提取率降低，因此，选择55、60、65℃作为响应面试验水平。

2.1.3 液料比对提取率的影响

按照方法1.3.2.3探究不同提取液料比对ODP的提取率的影响，结果见图3。

如图3所示，ODP提取率随着液料比的增加而增加，在液料比为20∶1（mL/g）时达到了峰值0.139%，浓度为45.87μg/mL，随后提取率随着液料比的升高而降低，在液料比35∶1（mL/g）后变化开始趋于平缓。说明溶剂液料比对提取率有显著的影响。因此，选择15∶1、20 ∶1、25 ∶1（mL/g）作为响应面试验水平。

图3 提取液料比对ODP提取率的影响Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on the polysaccharides content

2.1.4 pH值对提取率的影响

按照方法1.3.2.4探究不同提取pH值对ODP的提取率的影响，结果见图4。

图4 提取pH值对ODP提取率的影响Fig.4 Effect of pH on the polysaccharides content

如图4所示，ODP提取率随着pH值的变化波动甚微，总体趋于平缓，只在pH值过酸和过碱出现了先降后升的情况，而在绪论中论述酸碱环境对多糖的结构影响中提到过，过酸、过碱情况下都会一定程度对多糖的结构有损伤，故而，在响应面试验上不将pH值作为一个水平。

2.2 响应面优化仙人掌热水浸提法工艺

2.2.1 响应面结果方差分析

根据上述4个单因素试验结果分析，可见其中温度、时间、液料比3个因素对提取ODP有着显著的影响，使用Design-Expert.8.05试验设计见表2，对试验结果进行回归拟合得到响应面分析结果见图5至图7，得到回归方程：

Y=0.094+0.000 5X1+0.002 25X2+0.004 5X3-0.022X1X2+0.001 75X1X3-0.016X2X3-0.025X12+0.009 575X22-0.012X32，回归方程中各变量对响应值影响的显著性，由F检验来判定，P值（F＞Fα）越小，则相应变量的显著程度越高。从回归分析结果（见表3）可以看出，各因素中X12在10%显著水平下可认为显著，其它因素不是极显著，而且 F（X3）＞F（X2）＞F（X1）。方差模型（R2=0.998 5）R值越接近1.0，说明试验值与预测值的相关性越好。对回归方程取一阶偏导数等于零，整理如下：

表2 仙人掌热水浸提工艺响应面试验设计与结果Table 2 Box-Behnken experimental design matrix with experimental and predicted values on the yield of ODP

图5Z=f（X1，X3）的响应曲面和等高线Fig.5 Response surface and contour of Z=f（X1，X）

图6Z=f（X1，X2）的响应曲面和等高线Fig.6 Response surface and contour of Z=f（X1，X2）

图7Z=f（X2，X3）的响应曲面和等高线Fig.7 Response surface and contour of Z=f（X2，X3）

式（1）（2）（3）联立方程组，解得 X1=0.003 62，X2=0.027 96，X3=0.169 12，将X1X2X3带回回归方程得试验理论结果，为0.094 41%，验证模型的可靠性，课题中采用最佳提取工艺：提取温度为64.25℃，提取时间为 1.5 h，提取液料比为 22.38∶1（mL/g），在此条件下进行平行试验3次，实际得率为（0.114 2±0.027 3）%，预测值为0.114 8%与预测值误差为0.026 7%，与BBD预测值基本一致。因此，采用RSM优化得到的提取工艺参数可靠性佳。

表3 仙人掌多糖得率的回归方差分析表Table 3 Variance analysis of the regression equation for yield of ODP

2.2.2 响应图分析因素间的交叉关系

将模型中的某一因素固定在零水平作响应面图可获得另外两个因素的交互作用图。图形的响应曲面及其等高线图的形状可以反映交互效应的强弱（如图5、6、7）。响应面的抛物面开口向下，且有极大值点，说明所选因素水平里包括了最优组合[22]。等高线为椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则说明交互作用不显著。比较3组图可知：温度比对仙人掌多糖浸提的影响最为显著，表现为曲线较陡；而提取时间与料液比次之，表现为曲线较为平滑，且随其数值的增加或减少，响应值变化较小。

2.3 水提ODP抗氧化活性研究

配置不同浓度VC溶液作为阳性对照，分别采用了DPPH自由基、羟自由基、ABTS+自由基清除方法测定抗氧化性为仙人掌粗多糖溶液做参考。结果见图8、图9、表4。

图8 VC对3种自由基清除能力比较Fig.8 The compare about three kinds of radical scavenging ability of VC

图9 ODP对3种自由基清除能力比较Fig.9 The compare about three kinds of radical scavenging ability of ODP

表4 IC50结果Table 4 Results of IC50 mg/mL

由表4对比可以看出，仙人掌多糖对3种自由基均具有清除能力。随着ODP的浓度的升高，对DPPH自由基的清除率在增加，ODP浓度达到6.4 mg/mL前，对DPPH的清除率增幅明显，在6.4 mg/mL后增速逐渐趋于平缓，浓度达到25.6 mg/mL时清除率为90.03%。ODP对羟自由基的清除率曲线较DPPH自由基清除率曲线趋势更平缓，在浓度12.8mg/mL前清除率变化率大于浓度12.8 mg/mL后的清除率。ODP对ABTS+自由基的清除率如图所示，当浓度由0.8 mg/mL升至3.2mg/mL时，清除率变化明显，在浓度由3.2mg/mL至12.8 mg/mL时，清除率随着浓度的增加而增加，增速平衡，在ODP浓度达到12.8 mg/mL后，清除率没有明显的变化，趋于平缓，在最后的区间内清除率又瞬间有了增幅。由此可看出ODP对ABTS+自由基也有显著的清除效果，但清除效果随着ODP浓度的增加变化趋势不稳定。从表4中我们可以看出，DPPH自由基的IC50值小于羟自由基和ABTS+自由基的IC50值，说明ODP对DPPH自由基的清除能力强于另外两种自由基的清除能力。其中，羟自由基清除率的IC50值最大，说明ODP对羟自由基的清除率最弱。

3 结论与讨论

本课题探索的热水浸提新鲜仙人掌多糖的响应面优化最佳提取工艺为提取温度64.25℃，提取时间1.5 h，提取液料比 22.38 ∶1（mL/g），pH 值为 7，最优得率为 （0.114 2±0.027 3）%，ODP 浓度为 （37.686±9.009）μg/mL，相对于其他文献的多糖得率偏低，主要是因为提取率计算基数的不同，本课题直接使用新鲜仙人掌茎提取，提取率基数是新鲜仙人掌重量，而采用仙人掌干粉提取的文献中提取率基数是干粉重量，所以造成数据相差较大。

本课题探究了醇沉后粗多糖的抗氧化性。分别采用了DPPH自由基、羟自由基、ABTS+自由基清除方法，结果显示仙人掌多糖ODP对3种自由基均有良好的清除作用，且对3种自由基清除的能力为：DPPH自由基＞ABTS+自由基＞羟自由基。研究中发现简洁预处理下的仙人掌多糖得率虽然低，但是抗氧化活性相对于已有的抗氧化活性研究成果中，抗氧化性能更佳。

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Extracting Conditions and Antioxidant Activities of the Polysaccharides Extracted from Fresh Opuntia dillenii

YU Dan1，XIE Ya-fei1，SU Ning2，AN Quan3，ZHAO Dan1，WANG Chang-tao1，LI Meng1，*
（1.School of Science，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；2.Cosmetic Center，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176，China；3.Yunnan Baiyao Group Co.，Ltd.，Kunming 650500，Yunnan，China）

2017-07-17

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.007

中国检验检疫科学研究院基本科研业务费装箱资金资助项目（2015JK015）；质检公益性行业科研专项项目（201310132）；质检公益性行业科研专项项目（201410019）

虞旦（1993—），女（汉），硕士研究生在读，研究方向：化妆品原料。

*通信作者：李萌，女，副教授，博士，研究方向：化妆品原料。