饲喂高精料日粮对奶牛泌乳及相关调节因子的影响

谢正露,李金凤，张德明，王锦祥，桑 雷

(1.福建农林大学金山学院农业与生物技术系，福建福州 350002; 2.福建农林大学金山学院沙县祥云实践教学基地，福建沙县 365501; 3.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州 350002)

饲喂高精料日粮对奶牛泌乳及相关调节因子的影响

谢正露1,2*,李金凤2，张德明2，王锦祥3，桑 雷3

(1.福建农林大学金山学院农业与生物技术系，福建福州 350002; 2.福建农林大学金山学院沙县祥云实践教学基地，福建沙县 365501; 3.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州 350002)

为了解高精料日粮对泌乳奶牛乳产量的影响，选择12只健康经产奶牛，分别饲喂精粗比为40∶60(对照组)和60∶40(高精料组)的日粮，试验期12周，每周监测乳产量。试验期间每周采集血液样品用于测定外周血生长激素(GH)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)含量；试验结束，采集瘤胃液置-70℃保存待测，肝脏和乳腺组织于液氮速冻后置-70℃保存待测。结果表明，高精料日粮的饲喂显著降低了瘤胃pH(P<0.05)；奶牛外周血GH含量和IGF-1含量从第7周开始显著降低(P<0.05)；肝脏组织中生长激素受体(GHR)、蛋白质酪氨酸激酶2(JAK2)、信号传导与转录激活子5A(STAT5A)及信号传导与转录激活子5B(STAT5B)mRNA表达水平显著下调(P<0.05)；乳腺组织中， 胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)mRNA表达水平显著下调(P<0.05)。结果提示，长期饲喂高精料日粮会降低血液中GH和IGF-1含量，抑制GH-IGF-1轴的基因表达及关联的JAK2-STAT5信号途径的相关基因表达，从而减少了乳产量。

高精料日粮；GH/IGF-1轴；基因表达；乳产量；奶牛

奶牛泌乳功能是奶牛养殖的重要经济性状，其中乳产量和乳品质直接影响了奶牛养殖的经济效益。乳蛋白、乳脂肪和乳糖含量作为乳品质评价的内涵指标受到体内激素、生长因子及多种基因所调控。研究发现生长激素(growth hormone，GH)是体内重要的内分泌激素，调节机体脂解作用促进骨生成、糖异生、乳腺发育及维持泌乳等[1-2]。研究表明，奶牛体内GH与胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors-1，IGF-1)形成GH-IGF-1轴可有效调节泌乳反应，通过外源性提高GH含量可增加产乳，其脑垂体激素的浓度与奶牛泌乳量成正比关系，并且调节整个机体的物质代谢[1-2]。

外源性GH可以与牛的乳腺导管上皮的GH受体(growth hormone recepor,GHR)结合刺激牛乳腺上皮细胞大量增殖[3]。在反刍动物中GH 可以直接影响乳腺的功能，注射GH可使反刍动物产奶量显著提高[4-5]。Etherton T D等[6]指出直接注射GH可以提高动物的产奶量。应用外源bGH补给奶牛，发现在泌乳早期GH水平升高和胰岛素水平下降，同时抑制脂肪组织合成脂肪，加强脂肪组织的脂解作用[5]。GH对泌乳的调控机制一般认为是通过 IGF-1内分泌和旁分泌的介导作用，尤为重要的是GH可通过刺激肝脏产生IGF-1间接促进个体线性生长的效能[7-8]。并且，IGF-1通过调节体内营养分配来激活体内脂肪的分解，使更多的营养物质进入乳腺组织，从而增加泌乳[9]。本试验以泌乳期奶牛为研究对象，用不同精粗比日粮进行饲喂，通过监测乳产量，检测循环血液中GH和IGF-1的含量，肝脏和乳腺组织中相关基因表达水平的变化，探索在高精料日粮的饲喂条件下GH-IGF-1轴调控乳产量的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 选取泌乳奶牛12头(产犊后2周)，体重为518.46 kg±17.65 kg、临床检查健康，饲养于福建农林大学金山学院沙县祥云实践教学基地。

1.1.2 主要试剂 SYBR Green 荧光酶，瑞士Roach公司产品；M-MLV反转录酶、RNA抑制剂，美国Promega公司产品；随机引物、dNTP等，福州未来百珞生物技术有限公司产品；胰岛素样生长因子1酶联免疫检测试剂盒，上海朗顿生物科技有限公司产品；生长激素放射免疫测定试剂盒，购自北京北方生物技术研究所；其余试剂为分析纯。

1.1.3 主要仪器 WYJ2100型可见分光光度计尤尼柯；RT-6000型酶标分析仪，深圳雷杜公司产品；SN-695型智能放免γ测量仪，上海日环仪器一厂生产；MIKRO-22R型高速冷冻离心机、荧光定量PCR 仪，Bio-Rad公司产品；组织匀浆器，瑞士Kinematica AG公司产品；核酸浓度测定仪，EB公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与饲养管理 选取泌乳奶牛12头，随机分为2组，分别饲喂精粗比为40∶60(正常对照组，NC)和60∶40(高精料处理组，HT)的日粮(由芦苇草、玉米青贮、啤酒糟和精料组成)，自由饮水，每日饲喂时间为早上06:00、中午13:00和晚21:00。试验期12周，饲料营养成分见表1。

表1 日粮配方

注：* 1 kg预混料中含维生素A 250 000 IU；维生素D 60 000 IU；维生素E 1 025 mg；烟酸 396 mg；铁 696 mg；铜612.5 mg；锌2 908.5 mg；锰623.28 mg；碘37mg；钴8.5 mg；硒21 mg；钙179.2 g；磷68 g；氯9.44%；钠9.02%。

Note：* Provided per kg of premix Vitamin A 250 000 IU；Vitamin D 60 000 IU；Vitamin E 1 025 mg；Niacin 396 mg；Fe 696 mg；Cu 612.5 mg；Zn 2 908.5 mg；Mn 623.28 mg；I 37 mg；Co 8.5 mg；Se 21 mg；Ca 179.2 g；P 68 g；Cl 9.44%；Na 9.02%．

1.2.2 样品采集和处理 试验期间，每周通过颈静脉采集外周血液。将取得的新鲜血液注入肝素钠真空抗凝管中，以3 000 r/min室温离心15 min，取上清置-20℃待用。

试验期间，奶牛安装瘤胃瘘管。试验结束期牛采食完全后打开瘤胃瘘管盖，将瘤胃内容物通过多层纱布包裹、挤压、过滤得到瘤胃液，共持续12 h。测定pH后，样品置-20℃保存。

试验结束，通过活体穿刺分别采集肝脏和乳腺组织样品，用预冷的生理盐水清洗4次，迅速液氮冻存，置-80℃保存。

1.2.3 乳产量测定 试验期间，活塞单捅挤奶机挤奶(4:00～5:00和18:00～19:00)。挤奶前用消毒水清洗乳头和乳区，清水洗净。将前3把奶弃去后安装活塞单捅挤奶机，挤完后称重，记录乳产量。

1.2.4 血液GH和IGF-1含量的测定 通过GH放射免疫分析试剂盒测定血浆中GH的含量，测定方法按照试剂盒说明书进行。测定范围、灵敏度和计量标准参数按照文献[10]描述，SN-695型智能放免γ测量仪检测并获得数据。

通过IGF-1-ELISA检测试剂盒测定外周血浆IGF-1的含量，测定方法按照试剂盒说明书进行。以空白孔调零，450 nm波长测定各孔OD值。根据标准品的浓度及对应的OD值计算标准曲线的回归方程，再将样品OD值对应回归方程计算样品浓度。

1.2.5 肝脏和乳腺组织GH-IGF-1轴及相关信号通路中基因的表达水平检测

1.2.5.1 总RNA提取和cDNA合成 取80 mg左右的组织样本，用微量电动组织匀浆器彻底匀浆后采用Trizol抽提法提取总RNA。核酸测定仪测定总RNA的浓度，再根据样品OD 260 nm/OD 280 nm比值检测总RNA的纯度，当OD 260 nm/OD 280 nm比值在1.8～2.0之间表示所提取的RNA纯度好，可以进行下一步试验。

cDNA合成按照以下步骤进行：取2 μL 总RNA样品混合2 μL dNTP和2 μL Oligo(dT) 于Eppendorf管中，用DEPC水调整到10 μL，轻轻混匀。将上述混合物置于PCR仪中，72℃反应5 min，然后置于冰上冷却。最后，在上述混合物中加入0.2 μL RNAse inhibibor、0.5 μL M-MLV和2 μL 5×buffer，用DEPC水水调整到20 μL，混匀后置于PCR仪中，37℃ 1 h、95℃ 5 min，冰上冷却，并将合成的cDNA置-20℃保存备用。

1.2.5.2 Real-time PCR检测分析 用real-time PCR方法检测肝脏和乳腺组织中GH-IGF-1轴及相关信号通路的基因表达，包括IGF-1受体(IGF-1R)、GH受体(GHR)、蛋白质酪氨酸激酶2(JAK2)、信号转导与转录激活子1、3、5A和5B(STAT1、STAT3、STAT5A和STAT5B)、激素敏感酯酶(HSL)、脂蛋白酯酶(LPL)，基因序列从GenBank中查阅，根据引物设计原则，利用Primer 5软件设计，引物序列及相关参数见表2，引物由上海生工生物工程技术服务有限责任公司合成。

表2 引物序列及参数

本试验采用荧光定量PCR SYBR Green染料法对相关基因的mRNA表达进行定量分析，反应在MyiQ2 real-time PCR仪上进行，荧光酶是SYBR Green real-time PCR Master Mix，20 μL定量反应体系，其中SYBR Green荧光酶10 μL，R-primer 和F-primer 10 pmol/μL 2 μL、cDNA 2 μL、DEPC水6 μL。主反应条件为： 95℃ 30 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。循环结束后，2-ΔΔCt法计算出每个样本目标基因的表达。计算目的基因的相对量公式如下：

ΔΔCt=(CtTarget-Ctβ-actin)x-(CtTarget-Ctβ-actin)Control

其中ΔΔCt表示选择β-actin为内参，以正常对照组的目标基因和内标基因Ct差值的平均值作为参照，x表示任意一个样本。

1.2.6 数据统计分析 试验数据用SPSS16.0软件中Independent T-test模型进行数据处理。结果以Mean±SEM表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 高精料日粮饲喂对瘤胃pH和乳产量的影响

由图1显示，两组奶牛瘤胃pH低于5.6的持续时间超过3 h，有亚急性瘤胃酸中毒状态存在。

由图2显示，与对照组比较，高精料组奶牛乳产量在前3周差异不显著(P>0.05)。第4周起，高精料组奶牛乳产量开始呈现下降趋势。第7周至试验结束，高精料组奶牛的乳产量显著低于对照组乳产量(P<0.05)。

图1 高精料饲喂对奶牛瘤胃pH的影响

与对照相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)

Compared with control group,*P<0.05，**P<0.01

图2高精料日粮对乳产量的影响

Fig.2 Effect of high concentration diet treatment on the milk yield

2.2 高精料日粮饲喂对外周血中GH和IGF-1含量的影响

通过放射免疫技术和ELISA技术检测外周血血浆中GH和IGF-1含量。结果如图3显示，与对照组相比，试验开始前3周高精料组奶牛外周血中GH和IGF-1含量差异不显著(P>0.05)。第4周开始，高精料组奶牛外周血中GH和IGF-1含量与对照组相比显示一个下降的趋势，且在第7周至第12周显著下降(P<0.05)。

2.3 高精料日粮饲喂对肝脏和乳腺组织中GH/IGF-1轴及相关信号通路基因表达的影响

通过qPCR检测肝脏组织中GHR、JAK2、STAT1、STAT3、STAT5A和STAT5B mRNA表达水平，结果显示与对照组相比，高精料组奶牛肝脏组织中GHR、JAK2、STAT5A、STAT5B、HSL和LPL mRNA表达水平显著下调(P<0.05或P<0.01，图4A和4B)。

A.生长激素的含量；B.胰岛素样生长因子1的含量；与对照相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)

A.GH concentration; B.IGF-1 concentration; Compared with the control group,*P<0.05，**P<0.01

图3两组间外周血血浆中GH和IGF-1含量比较

Fig.3 Comparison of the contents of GH and IGF-1 in peripheral plasma between two groups

A.奶牛肝脏组织中GHR、JAK2、STAT1、STAT3、STAT5A和STAT5B mRNA表达水平；B.奶牛肝脏组织中HSL和LPL mRNA表达水平；C.奶牛乳腺组织中IGF-1R mRNA表达水平。与对照相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)

A.The mRNA levels of GHR,JAK2,STAT1,STAT3 and STAT5 genes in liver of dairy cows; B.The mRNA levels of HSL and LPL genes in liver of dairy cows; C.The mRNA level of IGF-1R gene in mammary gland of dairy cows.Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01

图4奶牛肝脏和乳腺中相关基因mRNA表达水平

Fig.4 The mRNA levels of associated genes in liver and mammary gland of dairy cows

通过real-time PCR检测乳腺组织中IGF-1R mRNA表达水平，结果显示，与对照组相比，高精料组奶牛乳腺组织中IGF-1R mRNA表达水平显著下调(P<0.05，图4C)。

3 讨论

反刍动物营养代谢是从瘤胃发酵开始的，改变瘤胃pH环境会影响瘤胃内发酵和营养成分的代谢。有研究表明，增加日粮高精料水平，瘤胃液pH会被降低[11]。本试验结果显示，高精料组奶牛瘤胃液pH显著降低，且低于5.8持续时间大于3 h左右，提示奶牛可能处于亚急性瘤胃酸中毒状态，不利于微生物生长，抑制瘤胃微生物的发酵水平，且会影响很多细胞因子的变化，同时改变了机体的代谢。

GH是参与反刍动物泌乳维持和合成代谢的重要激素，大量的研究表明其具有催乳效应，生产中也通过外源添加GH含量来增加乳产量[6]。其中，血液中内源性GH含量的提高还会直接影响乳汁形成，从而影响乳产量和乳品质[12]。本研究结果显示，与对照组奶牛相比，高精料组奶牛外周血血浆中GH含量出现下降，且乳产量也同步出现下降，表明在高精料日粮的饲喂条件下，奶牛体内合成和分泌的GH含量下降，在内源性GH含量降低，降低脂肪分解的效率减少能量供应，可能抑制了乳汁形成过程，奶牛乳产量随之降低。

许多研究证实，体内GH与IGF-1的变化对机体组织的分化、增殖及物质代谢有重要的影响[12-14]。GH在肝脏组织中与GHR结合，通过转磷酸化作用激活邻近的JAK2分子，激活的JAK2接着磷酸化STATs使其激活，激活的STATs转移到胞核中，当它与靶基因启动子GAS位点结合时将调控靶基因IGF-1表达[15]。在本试验中，通过对肝脏组织中GHR、JAK2、STAT1、STAT3、STAT5A和STAT5B mRNA表达水平检测，结果发现与正常对照组奶牛相比，高精料组奶牛肝脏组织中GHR、JAK2、STAT5A和STAT5B mRNA表达水平显著下调，与外周血血浆中GH和IGF-1结果吻合。

先前的研究指出，动物受到外源GH刺激时，将促进肝细胞IGF-1的合成，使外周循环血液中IGF-1的含量显著增加，血液中GH和IGF-1含量增加可显著提高乳产量，同时IGF-1能促进乳腺导管的发育[16-17]。在本试验中，高精料日粮饲喂显著降低外周血血浆中IGF-1含量。与正常对照组奶牛相比，高精料组奶牛乳腺组织中IGF-1R mRNA表达显著下调，与外周血血浆中IGF-1含量变化一致。结果提示IGF-1含量降低，减少IGF-1与IGF-1R结合，促进乳腺发育的功能被限制，并且促进泌乳的效应降低，导致乳产量下降。该结果反向证明了与前人研究中指出的提高循环血液中IGF-1的含量，可提高血流量，增加泌乳的结果相一致[1]。

综上所述，在高精料日粮饲喂的条件下，导致亚急性瘤胃酸中毒的发生，致使奶牛体内内源性GH含量降低，GH在肝脏组织中与GHR结合，通过JAK2-STAT5信号通路调节肝脏中IGF-1生成量，使得循环血中IGF-1含量下降，乳腺组织IGF-1与IGF-1R结合发挥促进泌乳作用减弱,下调了GH-IGF-1轴基因和JAK2-STAT5通路相关基因的表达，导致乳产量下降。

[1] Akers R M.Major advances associated with hormone and growth factor regulation of mammary growth and lactation in dairy cows[J].J Dairy Sci,2006,89(4): 1222-1234.

[2] Berryman D E,Christiansen J S,Johannsson G,et al.Role of the GH/IGF-1 axis in lifespan and healthspan: lessons from animal models[J].Growth Hormone & IGF Res,2008,18(6): 455-471.

[3] Kleinberg D L,Wood T L,Furth P A,et al.Growth hormone and insulin-like growth factor-I in the transition from normal mammary development to preneoplastic mammary lesions[J].Endocrine Rev,2009,30(1)：51-74.

[4] Harvey S,Martinez-Moreno C G,Luna M,et al.Autocrine/paracrine roles of extrapituitary growth hormone and prolactin in health and disease: An overview[J].Gen Compar Endocrinol,2015,220: 103-111.

[5] Boutinaud M,Rousseau C,Keisler D,et al.Growth hormone and milking frequency act differently on goat mammary gland in late lactation[J].J Dairy Sci,2003,86(2): 509-520.

[6] Etherton T D,Bauman D E.Biology of somatotropin in growth and lactation of domestic animals[J].Physiol Rev,1998,78(3): 745-761.

[7] 赵艳坤，邵 伟，王立文，等．IGF-Ⅰ及其受体对奶牛乳腺上皮细胞泌乳性能的影响[J].黑龙江畜牧兽医，2017(3)：58-62.

[8] 曾书秦，刁其玉，王建芬，等.不同能量水平饲粮对7～10月龄荷斯坦育成牛生长性能和血清指标的影响[J].动物营养学报，2015，27(2)：606-615.

[9] Cannata D,Lann D,Wu Y,et al.Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation[J].Endocrinology,2010,151(12): 5751-5761.

[10] Xie Z L,Ye P S,Zhang S K,et al.Endogenous LPS alters liver GH/IGF system gene expression and plasma lipoprotein lipase in goats[J].Physiol Rev,2015,64(5): 721-729.

[11] Xie Z L,Jiang X Y,Ye P S,et al.Relationship between liver and low rumen pH in goat[J].Gen Mol Res,2015,14(1):209-221.

[12] Delgadin TH,Pérez Sirkin D I,Di Yorio M P,et al.GH,IGF-I and GH receptors mRNA expression in response to growth impairment following a food deprivation period in individually housed cichlid fishCichlasomadimerus[J].Fish Physiol Biochem,2015,41(1): 51-60.

[13] Breves J P,Tipsmark C K,Stough B A,et al.Nutritional status and growth hormone regulate insulin-like growth factor binding protein (igfbp) transcripts inMozambiquetilapia[J].Gen Compar Endocrinol,2014,207: 66-73.

[14] 范岩岩，刘倩倩，张廷荣，等．转pGH-IGF-1基因对猪生长和繁殖性能的影响[J].中国兽医杂志，2016，52 (9)：15-18.

[15] Baik M,Yu J H,Hennighausen L.Growth hormone-STAT5 regulation of growth,hepatocellular carcinoma,and liver metabolism[J].Annals New York Acad Sci,2011,1229: 29-37.

[16] Han Y C,Sun Y G,Li Q.Growth hormone polymorphisms and growth traits in Chinese Tibetan sheepOvisaries[J].Genet Mol Res,2016,15(3): 1551-1557.

[17] 沈留红，巫晓峰，肖劲邦，等．回乳期奶牛血清GH、INS、HC、TGF-β1和IGF-1含量变化[J]．浙江农业学报，2017，29( 4)：548-554．

Abstract:In order to investigate the effect of feeding high concentrate diets on milk production,12 healthy multiparous dairy cows in mid-lactation were randomly divided in to two groups.One receiving a diet with normal control (concentrate: forage=40∶60) as the NC group,and another receiving a high concentrate diet treatment (concentrate: forage=60∶40) as the HT group.The experiment lasted for 12 weeks and milk production was monitoring every week.At the end of experiment,the rumen liquids were sampled and stored at -70℃,also liver and mammary tissue were sampled and stored at -70℃ by liquid nitrogen flash freezer for later gene expression analysis.During the experiment,the plasma samples were collected every week for determining the GH and IGF-1 concentrations.The results showed that the ruminal pH,milk yield,the plasma GH and IGF-1 concentrations of HT group were significantly decreased (P<0.05) after 7 weeks,compared with the NC group.The gene expressions of growth hormone receptor (GHR),protein-tyrosine kinase 2 (JAK2),signal transducer and activator of transcription 5A (STAT5A) and signal transducer and activator of transcription 5B (STAT5B) in liver,insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) in mammary gland,respectively,showed significant down regulation in the HT group compared with the NC group (P<0.05).These results suggest that prolonged feeding of a high concentrate diet could reduces the plasma GH and IGF-1 concentrations,down regulate the mRNA expression levels of GH-IGF-1 axis genes and associated with JAK2-STAT5 pathway genes,resulting in a decline in the milk yield.

Keywords:high concentrate diet; GH-IGF-1 axis; gene expression; milk yield; dairy cow

EffectsofHighConcentrateDietonLactationandRelevantRegulatoryFactorsinDairyCows

XIE Zheng-lu1,2,LI Jin-feng2,ZHANG De-ming2,WANG Jin-xiang3,SANG Lei3

(1.AgricultureandBiotechnologyDepartment,JinshanCollege,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian, 350002,China;2.ShaCountyXiangyunPracticeTeachingBase,JinshanCollege,FujianAgricultureandForestryUniversity,ShaCounty,Shaxian,Fujian,365501,China;3.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,FAAS,Fuzhou,Fujian,350002,China)

S852.21

A

1007-5038(2017)08-0057-06

2017-01-17

福建农林大学金山学院科研启动基金项目(Z150701)

谢正露(1986- )，男，福建建瓯人，讲师，博士，主要从事动物营养生理生化与代谢障碍研究。*