蛇代谢综合征继发感染细菌的分离鉴定及致病性试验

韩林梅,苏接瑜，覃炳雄，曾 芸*，李 军，廖河康

(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2.广西兽医研究所，广西南宁 530001；3.广西兽医生物技术重点实验室，广西 南宁 530001；4.广西陆生野生动物救护研究中心与疫源疫病监测中心，广西南宁 530001)

蛇代谢综合征继发感染细菌的分离鉴定及致病性试验

韩林梅1,苏接瑜1，覃炳雄1，曾 芸1*，李 军2,3*，廖河康4

(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2.广西兽医研究所，广西南宁 530001；3.广西兽医生物技术重点实验室，广西 南宁 530001；4.广西陆生野生动物救护研究中心与疫源疫病监测中心，广西南宁 530001)

近年来，广西人工饲养的蛇发生代谢障碍综合征后，病死率较高，为查清原因，对临床接诊的18例蛇代谢障碍综合征病例的心、肝、脾等脏器病料进行细菌分离鉴定，并测定分离菌对小鼠和蛇的致病力。结果从18例病蛇的不同组织器官中分离到10株细菌，PCR结合生化试验方法，鉴定出4种细菌，分别为粪肠球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌和弗格森氏大肠埃希菌，并对其进行种系发育关系分析。所鉴定的4种细菌对昆明小鼠和蛇的致病力差异较大，克氏葡萄球菌和弗格森氏大肠埃希菌对昆明小鼠有较强致病性，粪肠球菌和缓慢葡萄球菌对昆明小鼠致病力较弱；克氏葡萄球菌对眼镜蛇有致病性，其余菌对王锦蛇、眼镜蛇、滑鼠蛇均无致病性。

代谢综合征；细菌；鉴定；致病力；蛇

蛇代谢综合征是指蛇体自身代谢物排泄障碍引起尿酸沉积在血管、黏膜或实质器官引发的物质代谢失常的综合征[1]。该病分原发性和继发性两种类型。原发型以短期高蛋白饲养为诱因，以肥胖蛇多见，呈散发性发病，病死率低，只有继发感染才出现比较高的病死率；继发型则与细菌感染、用药混乱、长期缺水等因素有关[2]。

引起蛇发病的细菌多是革兰阴性细菌,少部分属于革兰阳性细菌。蛇口腔中的常在菌包括假单胞菌、变形杆菌、克雷伯菌、肠杆菌、细球菌和棒状杆菌；粪便中的常在菌有变形杆菌、沙门菌、亚利桑那菌和球菌[3]。王金才等[4]从黑眉锦蛇分离到沙门菌和变形杆菌；何伟成从蟒蛇分离到气单胞菌[5]；李婉萍等[6]从蟒蛇分离到铜绿假单胞菌；李方青等[7]从王锦蛇、灰鼠蛇分离出变形杆菌；肖杨等[8]从滑鼠蛇、草花蛇中分离到沙门菌；曾芸等[9]从眼镜蛇分离出变形杆菌。

近年来，广西人工饲养蛇的代谢障碍综合征呈现病死率较高，为了查清原因，本文对临床接诊的18例蛇代谢障碍综合征病例进行细菌分离和鉴定，并对分离细菌进行小鼠与蛇的致病力试验，分析蛇发生死亡的主要原因，探寻解决方法，为有效防治蛇代谢综合征提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 20日龄的昆明小鼠15只，平均体重20 g，购自广西医科大学实验动物中心；3月龄眼镜蛇(53 g)、滑鼠蛇(50 g)、王锦蛇(48 g)各15条，由南宁市馨宇蛇类养殖基地提供。

1.1.2 病例来源 南宁市及周边邻县养蛇场送检的患病蛇。

1.1.3 主要试剂和器材 营养琼脂培养基，北京陆桥技术股份有限公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司产品；微量生化反应管，杭州天和微生物试剂有限公司产品；麦氏比浊管由广西大学动物科学技术学院药理实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 病理剖检与临床诊断 将送检蛇在实验室进行病理剖检，观察患病蛇的主要病理变化；同时取内脏器官表面的白色物进行显微镜检和200 g/L NaOH溶解试验。

1.2.2 细菌分离 无菌采取临床诊断为代谢障碍综合征患病蛇的心、肝、脾和肾，划线接种于营养琼脂培养基，37℃恒温培养24 h后，挑单个菌落继续划线接种在营养琼脂培养基进行细菌的纯分离，观察并记录细菌的生长特性，并进行革兰染色分类。

1.2.3 分离菌的生化试验 参照《伯杰细菌鉴定手册》[10]的操作方法，将纯化的细菌分别接种于生化反应管，置37℃恒温培养24 h～48 h观察生化反应结果，同一项目进行2个重复。

1.2.4 16 S rRNA测序鉴定 选择菌落形态、生长特性和生化反应完全不一样的细菌分离株，按细菌基因组DNA提取试剂盒的说明提取细菌DNA，采用通用引物16 S-1492R和16S-27F扩增细菌16 S rRNA[11]，扩增产物送上海英骏生物技术有限公司测序，对序列进行同源性比对及种间比对。

1.2.5 DNA序列数据的处理及分子系统树的构建 从GenBank上获取已登录的所有粪肠球菌C1W1基因序列、克氏葡萄球菌S4基因序列、缓慢葡萄球菌BGZ-7基因序列和弗格森氏大肠埃希菌DH-32基因序列进行种内比对。序列信息见表1。

应用Lasergene7(SeqMan)对表1序列及测序结果进行校对。粪肠球菌以C1W1基因以外的基因为外群。克氏葡萄球菌以KJ888112、KJ441744和JX102547为外群。缓慢葡萄球菌以KX950708、KX525724和KM378611为外群。弗格森氏大肠埃希菌以KT287075、JX013427为外群。应用Clustal W在线软件进行多重序列比对，然后利用MEGA5邻位相连法(Neighbor-join-ing,NJ)分别进行构建树。

1.2.6 细菌对小鼠和蛇致病力测定 将测序鉴定的细菌划线接种于营养琼脂培养基，37℃恒温培养24 h，用灭菌生理盐水洗下菌落，采用麦氏比浊法将细菌配制为3×109CFU/mL的细菌悬液[12]，按0.2 mL/10 g给昆明鼠腹腔注射细菌悬液，每种细菌接种3只昆明鼠，对照组注射等剂量的生理盐水，观察并记录接种细菌后昆明鼠的反应和死亡率，死亡昆明鼠进行细菌分离鉴定。从死亡鼠的心肝肺回收到接种菌，对照鼠试验期内无异常。

表1 4种菌的参考菌株

按上述方法分别将细菌接种于眼镜蛇、滑鼠蛇、王锦蛇，每种蛇接种3条，观察并记录不同种类蛇接种细菌后的反应和死亡率，死亡蛇进行细菌分离鉴定。从死亡蛇心肝分离到接种菌，对照蛇在试验期内无异常。

2 结果

2.1 病理解剖与临床诊断

送检的18例患病蛇心包膜和肝脏表面可见有大量的白色沉积物(图1)，肾脏肿大充满白色颗粒样物、输尿管有白色沉积物(图2)，光学显微镜下观察白色沉积物呈结晶状(图3)，白色沉积物滴加200 g/L NaOH后，缓慢溶解(图4)。

图1 王锦蛇心和肝白色沉积物

2.2 细菌分离结果与细菌生长特性

从18病患病蛇的病理剖检与临床诊断为代谢障碍综合征的心、肝、脾和肾中分离得到10株细菌，细菌的生长特性见表2。

2.3 分离菌的生化反应结果

按照生化特性试验方法进行生化鉴定，4种菌株结果与东秀珠、蔡妙英主编《常见细菌系统鉴定手册》[13]中摩氏摩根菌的生化特性相一致。

图2 滑鼠蛇输尿管堵塞

图3 显微镜下结晶物形态(40×)

图4 显微镜下结晶物溶解形态(40×)

1号、2号、3号分离菌：精氨酸双水解、马尿酸盐水解、D-木糖、蔗糖、D-乳糖、D-甘露醇的生化反应呈阳性，硝酸盐还原、VP、棉籽糖呈阴性(表3)。

4号、5号、6号分离菌：马尿酸盐水解、D-甘露醇、D-乳糖呈阳性，硝酸盐还原、精氨酸双水解酶、 VP、D-木糖、棉籽糖、蔗糖呈阴性(表4)。

7号、8号分离菌：棉籽糖、蔗糖、 D-甘露醇、D-乳糖、硝酸盐还原呈阳性，精氨酸双水解，马尿酸盐水解,VP 、D-木糖阴性(表5)。

9号、10号分离菌对吲哚、 OPNG、葡萄糖产气、赖氨酸脱羧、精氨酸双水解、鸟氨酸脱羧、D-甘露醇、氰化钾阳性，对甲基红、柠檬酸盐利用、三糖铁产硫化氢、马尿酸盐水解、苯丙氨酸脱氢阴性(表6)。

表2 10株细菌的生长特性

表3 病原分离株生化特性试验结果

注：+，阳性；-，阴性。

Note：+,Positive;-,Negative.

表4 病原分离株生化特性试验结果

注：+，阳性；-，阴性。

Note：+,Positive;-,Negative.

表5 病原分离株生化特性试验结果

注：+，阳性；-，阴性。

Note：+,Positive;-,Negative。

表6 病原分离株生化特性试验结果

注：+，阳性；-，阴性。

Note:+,Positive;-,Negative.

2.4 16 S rRNA测序结果

根据细菌形态特点和生化性质表现一致的，选择代表株2号菌株、5号菌株、7号菌株和9号菌株进行DNA提取和16 S rRNA序列扩增，扩增结果见图5。获得的序列在NCBI上进行同源性比对，结果2号、5号、7号、9号菌株分别与粪肠球菌(KF254548.1)、克氏葡萄球菌(JQ660155.1)、缓慢葡萄球菌(KM378611.1)、弗格森埃森菌(KF646704.1)高度同源，同源性达99%以上。

2.5 种系发育关系分析

粪肠球菌蛇分离株(56)与KF254548构成一个单独分支。KY523584、KY523583、KY010411、KX018440、KU200452与本株同属一个分支(图6)。

克氏葡萄球菌蛇分离株(S4-437)与HQ179005、JQ660155、HM321442属同一分支，HQ179005和JQ660155构成一个单独分支。与KJ888112、KC441744、JX102547属于不同分支(图7)。M.DNA标准DL 2 000; 1. 2号菌株; 2. 5号菌株; 3. 7号菌株；4. 9号菌株；5.阳性对照；6.阴性对照缓慢葡萄球菌蛇分离株(BGZ-7)所构建的树与克氏葡萄球菌形状像似，与HQ437165、KC951997、HM815537、FJ893453属于同分支，HQ437165和KC951997构成一个单独分支。与KX950708、KX525724、KM378611属于不同分支(图8)。

M.DNA Marker DL 2 000; 1. No.2; 2:No.5; 3. No.7;4.No.9;5.Positive control;6.Negative control

图5细菌16 S rRNA PCR扩增结果

Fig.5 PCR amplification results of 16 S rRNA

图6 粪肠球菌系谱关系

图7 克氏葡萄球菌系谱关系

弗格森氏大肠埃希菌蛇分离株(DH-32)与KF646704单独属于一分支。与KT275828、KX162658、KP418799属于同一分支。同属于KT287075分支之一(图9)。

2.6 分离菌对动物的致病力

昆明小鼠腹腔注射细菌悬液4 h后，出现不同程度的呼吸急促。6 h后出现精神沉郁、打堆、被毛竖立、颤抖的现象。8 h～24 h，小鼠陆续死亡。24 h后存活者继续饲养1周，没有出现死亡。

图8 缓慢葡萄球菌系谱关系

图9 弗格森氏大肠埃希菌系谱树

接种5号、9号分离菌的3只昆明小鼠全都死亡，死亡率100%。接种2号分离菌的3只组死亡2只，死亡率66%。接种7号分离菌的3只组死亡1只，死亡率33%。从死亡昆明小鼠心、肝分离到接种菌。

眼镜蛇、王锦蛇、滑鼠蛇腹腔注射细菌悬液24 h后，蛇均未出现异常。36 h后，接种5号分离菌的眼镜蛇相继出现离窝，精神不振，反应迟钝的现象，72 h后，3条眼镜蛇全部死亡，死亡率100%。存活蛇继续饲养1周，均未出现死亡。从死亡眼镜蛇心、肝分离到与接种菌。

3 讨论

通过对临床诊断为蛇代谢障碍综合征的18个病例进行细菌分离，结果获得10株细菌，生化和16 S rRNA分子鉴定为3株粪肠球菌，3株克氏葡萄球菌，2株缓慢葡萄球菌，2株弗格森氏大肠埃希菌。动物致病力试验可知分离菌对昆明鼠具有明显的致病力，但是对蛇致病力较弱，而且分离菌对蛇种间的致病力有差异，只有克氏葡萄球菌对眼镜蛇具有明显的致病性。

缓慢葡萄球菌、克氏葡萄球菌、粪肠球菌和弗格森氏大肠埃希菌均为条件性致病菌，广泛分布于环境、人和动物的体表或肠道。患有代谢障碍综合征的蛇随着病情发展，机体免疫力下降等影响，可能会继发引起这些细菌感染，进一步加剧病情，从而出现高的死亡率[14]。所以对蛇代谢障碍综合征的诊断和治疗中不能忽视可能出现的细菌继发感染。

人工饲养的蛇类可能都会出现代谢障碍综合征，但在临床检出率中以眼镜蛇发病率较高，这很可能与眼镜蛇饮食习惯有关[15]，眼镜蛇对食物种类、品质要求不高，且具有暴食的特点，一次性会食入大量的食物，加上规模化、密集化养殖，蛇活动空间小，长期大量食入高蛋白的鸡胚、鸭胚或青蛙，可能会引起代谢障碍疾病。因此通过控制食物投放量、采取定期投放、提供合适的运动空间等方式可以有效地预防蛇代谢障碍综合征的出现。

不同动物对同种细菌的免疫能力存在着差异，而本试验出现的差异很大，最大的原因可能是温度的影响，在做细菌对蛇的试验时温度过低，不利于细菌的繁殖生长，同时低温使蛇进入半冬眠状态，血液流动减慢，细菌感染速度减慢。同时，从第2天温度上升，第3天有蛇死亡，而分离出来的菌为所注射的细菌，可以得出温度影响是最大的原因。

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Abstract:The snake metabolic syndrome was broken in artificial feeding snakes in Guangxi recently. For its high mortality, the pathogens of snake metabolic syndrome were investigated. Bacteria were isolated and identified from heart, liver, spleen of 18 cases of snake metabolic syndrome, and their pathogenicity were tested in mice and snakes.The results showed that 10 strains of bacteria were isolated from different organs of sick snakes.Enterococcusfaecalis,Staphylococcuskloosii,Staphylococcuslentus,Escherichiafergusoniiwere identified by PCR and biochemical tests.The virulences of 4 species of bacteria to mice and snakes were different.StaphylococcuskloosiiandEscherichiafergusoniihad strong pathogenicity to mice,however,EnterococcusfaecalisandStaphylococcuslentusappeared low virulence.Enterococcusfaecalis,StaphylococcuslentusandEscherichiafergusoniiwere avirulent toElaphecarinata,cobra andPtyasmucosus,except thatStaphylococcuskloosiiwas virulent to cobra.

Keywords:metabolic syndrome; bacteria; identification; pathogenicity；snake

IdentificationandPathogenicityofBacteriaIsolatedfromSnakeMetabolicSyndrome

HAN Lin-mei1,SU Jie-yu1,QIN Bing-xiong1,ZENG Yun1,LI Jun2,3,LIAO He-kang4

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530004 ,China; 2.GuangxiVeterinaryResearchInstitute,Nanning,Guangxi,530001,China; 3.GuangxiKeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalTechnology,Nanning,Guangxi,530001,China; 4.GuangxiTerrestrialWildlifeRescueResearchCenterandEndemicDiseaseMonitoringCenter,Nanning，Guangxi,530001,China)

S865.32

A

1007-5038(2017)08-0043-06

2016-12-06

南宁市2016年科技项目(20163355)

韩林梅(1989-)，女，河南郑州人，硕士研究生，主要从事药理与毒理学研究。*