过硫酸氢钾复合物最佳杀菌条件的研究

冯 秀，王爱玲，张振仓，张为民，周宏超，张彦明，郭抗抗*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.杨凌职业技术学院，陕西杨凌 712100)

过硫酸氢钾复合物最佳杀菌条件的研究

冯 秀1△，王爱玲1△，张振仓2，张为民1，周宏超1，张彦明1，郭抗抗1*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.杨凌职业技术学院，陕西杨凌 712100)

以过硫酸氢钾消毒剂为研究对象，以大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌为受试菌，通过悬液定量杀菌试验，研究在不同温度、作用时间和干扰物存在条件下，过硫酸氢钾的杀菌作用。结果显示，有机干扰物不存在时，在设定温度下(37、25、4℃)，浓度为312.5 mg/L～1 250 mg/L的过硫酸氢钾对受试菌(107CFU/mL)作用5 min，杀菌率为100%；浓度为2 500 mg/L时，1 min可完全杀灭受试菌。当有机物(牛血清白蛋白)在菌液中的终浓度为30 g/L时，室温下作用10 min，完全杀灭大肠埃希菌浓度为625 mg/L，金黄色葡萄球菌为2 500 mg/L。有机物含量为250 g/L时，相同条件下对大肠埃希菌的杀菌率为99.99%，对金黄色葡萄球菌的杀菌率为99.97%。研究结果为过硫酸氢钾作为消毒剂的有效使用提供了参考。

过硫酸氢钾；大肠埃希菌；金黄色葡萄球菌；杀菌效果

消毒是扑灭动物疫情的重要措施之一，过硫酸氢钾复合物是一种无机酸性氧化剂，一般是指单过硫酸钾或单过硫酸氢钾，可用于畜舍消毒、水体消毒、纸浆漂白和羊毛织物的防缩处理等[1]，还可作为有机合成中的重要辅助剂、污水处理中含硫物质的氧化剂及水产养殖中的供氧剂。过硫酸氢钾复合物是由过硫酸氢钾(KHSO5)、硫酸氢钾(KHSO4)和硫酸钾(K2SO4)组成的固体物质，KHSO5是其主要的活性物质，具有极强的氧化能力；易溶于水，可在水体中产生各种高活性的小分子自由基和活性氧等衍生物，一般不形成有毒副产物，使用安全性高，符合环保要求[2]；通常状态下性质稳定，不易分解，活性高，可参与多种化学反应；杀菌原理主要是利用单过硫酸氢钾的特殊氧化能力和链式反应，即在水溶液中不断产生新生态氧、次氯酸、自由羟基、过氧化氢，通过新生态氧和自由羟基的氧化作用可以改变细胞膜的通透性使之破裂，从而达到杀灭病原微生物的目的[3]。在动物养殖过程中，为了防止疫病病原的感染和发病，使用化学药物进行环境和场所的消毒是一项经常性的工作，但是也存在由于长期使用相同的消毒剂导致致病菌产生了耐药性，杀菌效果降低的问题[4]。过硫酸氢钾由于其独特的杀菌原理，不仅可以杀灭氯制剂或表面活性剂所不能杀灭的致病菌，而且不会使病原菌产生耐药性，所以以过硫酸氢钾为主要成分的消毒剂在养殖场被广泛的使用，但在使用过程中也发现一些问题，如消毒剂的使用浓度、作用时间、环境干扰物及温度都会影响其作用效果，虽然通过提高消毒剂浓度的方式可以提高消毒的效果，但是增加了成本，甚至会对环境造成污染和危害。由于环境中各种不同因素的影响(包括季节性的温度变化和畜舍中有机物浓度大小等)，消毒剂在杀灭病原菌时所需要的浓度和作用时间也会发生改变[5]。在生产实践中，许多养殖人员在使用消毒剂对病原菌进行扑灭时很少去评估环境因素对其杀菌效果的影响，使用浓度过高的消毒液会造成对消毒剂的浪费，使用浓度过低的消毒液会导致病原菌不能被完全杀死。研究在不同温度和不同有机物存在的情况下过硫酸氢钾的杀菌效果来确定其在不同环境中的最佳使用浓度，确定消毒剂的最佳作用条件，合理的使用消毒剂，对提高养殖效益和保护环境安全都具有重要意义。

本研究以猪场常见的病原微生物为受试菌，对不同条件下过硫酸氢钾的最佳杀菌作用进行了研究。致病性大肠埃希菌是引起仔猪腹泻的主要病原之一，为革兰阴性菌，作为肠道致病菌的代表，大肠埃希菌不仅在公共卫生学方面具有重要的检测意义，而且可作为消毒试验效果的指示菌[6]；金黄色葡萄球菌为革兰阳性菌，在养猪场广泛存在，属于条件致病菌，易引起哺乳仔猪和断奶仔猪发生渗出性皮炎，严重者可能会引起败血性死亡[7]。作为猪场常见的致病菌。大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌易引起仔猪感染发病和食品污染，不仅给养猪户带来了巨大的经济损失，而且还威胁到了食品安全和人类健康[8-9]。因此，本研究选择大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌作为受试菌，研究过硫酸氢钾的最佳杀菌条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 大肠埃希菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)均从猪场送检的病料中分离获得，由西北农林科技大学动医学院兽医公共卫生学实验室提供。

1.1.2 主要试剂和培养基 牛血清白蛋白(批号：JS10780)，上海金穗生物科技有限公司产品；硫代硫酸钠(CAS号7772-98-7)，上海迈瑞尔化学技术有限公司产品；过硫酸氢钾(批号：091101)。

磷酸盐缓冲液(PBS)的配制：取2.83 g的无水磷酸氢二钠和1.36 g的磷酸二氢钾，加蒸馏水溶解，pH调至7.2，定容至1 000 mL，121℃高压蒸汽灭菌10 min，4℃保存备用。

中和剂(硫代硫酸钠)的制备：100 mL磷酸盐缓冲液(PBS)加入300 mg硫代硫酸钠，121℃高压蒸汽灭菌15 min，4℃保存备用。

过硫酸氢钾消毒剂的配制：100 g/L临用前用磷酸盐缓冲液PBS配制成不同浓度的溶液[10]。LB液体培养基配制和平板计数琼脂培养基配制参照文献[11]进行。

1.2 方法

1.2.1 受试菌浓度的确定及计数 将冻存的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌种分别接种于4 mL的含血清的LB液体培养基中，恒温箱中37℃培养12 h～18 h；用接种环取1环菌液划线于血清琼脂平板，37℃培养24 h～48 h；观察菌落形态，挑取典型菌落染色镜检、选取单菌落于LB液体培养基中进行大量培养37℃培养12 h～16 h，4℃保存备用。

菌落计数：对获得的菌液进行10倍梯度稀释，分别接种到营养琼脂平板上，进行菌落计数。具体操作按照《消毒技术规范》(2002)和《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》(GB4789.2-2016)进行。

1.2.2 菌悬液的制备 按照《消毒技术规范》(2002)的要求，在菌落计数的基础上，调整大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的细菌数为1×107CFU/mL～5×108CFU/mL。

1.2.3 硫代硫酸钠对过硫酸氢钾的中和作用试验 《消毒技术规范》(2002)要求，一种消毒剂对多种细菌进行杀菌试验时，任选其中的一种细菌进行中和剂鉴定，所用消毒剂的浓度应以杀菌试验中的最高浓度为准。将大肠埃希菌作为过硫酸氢钾中和剂鉴定的代表菌，过硫酸氢钾的浓度为2 500 mg/L。按1∶9的比例配制菌悬液和消毒剂，共6组。a组：消毒剂+菌悬液，用于验证消毒剂的杀菌效果；b组(消毒剂+菌悬液)+中和剂，用于验证消毒剂在杀灭细菌后能否被完全中和；c组中和剂+菌悬液，用于验证中和剂对细菌的生长是否有抑制作用；d组(消毒剂+中和剂)+菌悬液，用于验证中和产物对细菌的生长是否有抑制作用；e组稀释液+菌悬液，为阳性照组；f组稀释液+中和剂，为阴性对照组

具体操作：将0.5 mL菌(107CFU/mL)悬液加入装有4.5 mL消毒剂(2 500 mg/L)的试管中，室温下作用5 min；取0.5 mL的混合液加入到装有4.5 mL中和剂(3 g/L硫代硫酸钠)的试管中，作用10 min；做1 000倍的稀释，取100 μL涂布到琼脂平板上(做两块板)，37℃培养18 h～24 h后，计算细菌菌落数。每个试验重复3次，结果取平均值。

1.2.4 过硫酸氢钾杀菌条件的研究

1.2.4.1 试验条件下过硫酸氢钾的杀菌作用 用灭菌生理盐水将大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌浓度调整至1×107CFU/mL～5×108CFU/mL，在预试验的基础上用灭菌PBS缓冲液将过硫酸氢钾配制成2 500、1 250、625、312.5 mg/L。

分别研究不同浓度消毒剂、不同作用温度、不同作用时间时，过硫酸氢钾对受试菌的杀灭作用。具体操作如下：于灭菌试管中加入4.5 mL消毒剂和0.5 mL菌悬液(107CFU/mL)，置于设定好的温度下分别作用一定时间(1 min或5 min)，加入4.5 mL中和剂(3 g/L硫代硫酸钠)，混匀，作用10 min；取0.1 mL的作用液接种于琼脂平板，37℃培养24 h，统计菌落数，统计过硫酸氢钾的杀菌率。每种条件下试验重复3次，结果取平均值。阳性对照用PBS代替消毒剂，阴性对照用PBS代替消毒剂和菌液，其他条件相同。

1.2.4.2 干扰物存在时过硫酸氢钾的杀菌作用 按照《消毒技术规范》(2002)的操作进行。分别给大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的菌悬液中分别加入牛血清白蛋白(终浓度分别为30 g/L和250 g/L)，消毒剂的杀菌温度设定为25℃，作用时间为1、5、10 min。当杀菌效果较低时，将消毒剂的最低杀菌浓度进行加倍，直至产生明显的杀菌效果即可，其他条件同1.2.4.1。

2 结果

2.1 中和剂的作用条件

根据《消毒技术规范》(2002)中和剂鉴定合格判断标准，从表1可以看出：a组没有菌落生长；b组介于a组和c、d、e组之间；c、d、e三组间的生长菌落数非常相近，且误差不超过15%；f组没有细菌生长；说明3 g/L硫代硫酸钠可以中和2 500 mg/L的过硫酸氢钾，能满足试验的要求。

表1 硫代硫酸钠对过硫酸氢钾的中和作用

2.2 试验条件下过硫酸氢钾的杀菌作用条件

当没有有机干扰物时，在选择的温度条件下(37、25、4℃)，浓度为312.5 mg/L～1 250 mg/L的过硫酸氢钾对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌(107CFU/mL)作用5 min，杀菌率可达100%，作用1 min并不能完全杀灭受试菌。当过硫酸氢钾浓度为2 500 mg/L时，仅需1 min对两种试验菌的杀菌率可达100%。结果见表2。

2.3 有机物干扰时过硫酸氢钾的杀菌作用

当有机物(牛血清白蛋白)在菌液中的终浓度为30 g/L时，室温下作用10 min，过硫酸氢钾复合物完全杀灭大肠埃希菌(107CFU/mL)浓度为625 mg/L，而杀灭金黄色葡萄球菌的浓度为2 500 mg/L。当菌液中有机物含量为250 g/L时，室温下作用10 min时，浓度为625 mg/L的过硫酸氢钾对大肠埃希菌的杀菌率为99.99%；2 500 mg/L过硫酸氢钾对金黄色葡萄球菌的杀菌率为99.97%。结果见表3。

表2 过硫酸氢钾对受试菌的杀灭作用

表3 有机物对过硫酸氢钾杀灭细菌的影响

3 讨论

消毒是防控细菌性疾病的有效措施，坚持日常消毒可以减少细菌性疾病的发生，消毒剂的选择和正确使用是取得理想消毒效果的关键[11]。在自然条件下，由于季节的转变和畜舍中粪便、饲料等有机物含量的不同会影响消毒剂的杀菌效果。通过对过硫酸氢钾消毒剂杀菌效果的研究，我们发现在一定范围内，温度越高，相同浓度的过硫酸氢钾消毒剂对同一种细菌的杀灭作用会增强。同样，作用时间越长，杀灭效果越好，消毒剂浓度越高，杀菌效果越好。同时，当有机干扰物存在时，相同浓度的消毒剂作用效果会减弱，且过硫酸氢钾作为消毒剂使用时对革兰阴性菌的杀灭作用要好于革兰阳性菌。在生产中使用消毒剂对病原菌进行杀灭时，适当升高温度和延长作用时间，可提高消毒剂的杀菌率。相反的，当环境温度较高时，可适当调低消毒剂浓度，也可达到杀灭细菌的作用，减少消毒剂的浪费。当畜舍中存在较多有机物时，增加消毒的浓度，可提高消毒剂的杀菌作用，浓度过低会造成病原菌不能被完全杀灭。

过硫酸氢钾消毒剂对皮肤无刺激，对动物无毒性损伤[12],但在水中投加量较大时，用于消毒仍有一定的安全风险。生产中要根据季节中温度的变化和畜舍中粪便、饲料等有机物存在的多少来选择不同浓度的过硫酸氢钾，在对有较多有机物存在的猪场进行消毒时，适当提高消毒剂的浓度和作用时间，可取得良好的消毒效果。

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Abstract:In the experiment,potassium monopersulfate disinfectant was choosed as the research object,EscherichiacoliandStaphylococcusaureuswere selected as trial bacteria for studying the sterilization effect of potassium monopersulfate at different temperatures,time and organics.Both bacteria(107CFU/mL) were completely killed at 37,25,4℃ for 5 minutes with disinfectant’s concentration from 312.5 mg/L to 1 250 mg/L; and in the same condition,they were completely killed after one minute with disinfectant’s concentration at 2 500 mg/L.there were 30 g/L organics in bacteria suspension,E.coliwere completely killed at 25℃ for 10 min with disinfectant’s concentration at 625 mg/L; andS.aureuscompletely killed with disinfectant’s concentration at 2 500 mg/L.In the same condition,there were 250 g/L organics in bacteria suspension,the killing rate ofE.coliis 99.99% andS.aureusis 99.97%.This study provided the basis for using potassium monopersulfate effectively.

Keywords:potassium monopersulfate;E.coli;S.aureus; disinfection effect

StudyonOptimumSterilizationConditionsofPotassiumMonopersulfateCompound

FENG Xiu1,WANG Ai-ling1,ZHANG Zhen-cang2,ZHANG Wei-min1,ZHOU Hong-chao1, ZHANG Yan-ming1,GUO Kang-kang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China; 2.YanglingVocational&TechnicalCollege,Yangling,Shaanxi,712100,China)

S859.7991

A

1007-5038(2017)08-0039-04

2017-01-05

陕西省重点农业科技示范推广项目(ZDKJ-2014-33)

冯 秀(1991-)，女，陕西延川人，硕士研究生，主要从事猪重要疫病防控研究。王爱玲(1990-)，女，山东临沂人，硕士，主要从事猪重要疫病防控技术研究。△同等贡献作者*