热灭活无乳链球菌对奶牛乳腺成纤维细胞TGF-β1及其受体表达的影响

张芮今，丁玉林，毕艳楠，赵 弥，郭运泽，王凤龙

(内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018)

热灭活无乳链球菌对奶牛乳腺成纤维细胞TGF-β1及其受体表达的影响

张芮今，丁玉林，毕艳楠，赵 弥，郭运泽，王凤龙*

(内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018)

研究无乳链球菌(GBS)对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)转化生长因子β1(TGF-β1)及其受体TβRⅠ表达的影响。6代和7代BMFB，在6、12、24、48 h时间点，分别用无血清培养液和105、106、108CFU/mL的不同浓度的热灭活GBS作用于BMFB细胞。 RT-qPCR法检测TGF-β1及TβRⅠ mRNA的表达，Western blot法检测TGF-β1和TβRⅠ蛋白的表达。与对照组相比，TGF-β1mRNA的表达量明显升高，于24 h达到最大值(P<0.05)；TGF-β1蛋白的表达于12 h达到最大值，24 h蛋白表达量开始明显降低(P<0.05)。TβRⅠ mRNA的表达量较对照组的升高，在48 h达到峰值(P<0.05)；TβRⅠ蛋白表达量在12 h低于6 h，24 h达到峰值，之后又下降(P<0.05)。说明热灭活无乳链球菌对BMFB TGF-β1及TβRⅠ mRNA和蛋白的表达有促进作用。

热灭活无乳链球菌；奶牛乳腺成纤维细胞；转化生长因子β1；TβRⅠ

无乳链球菌(Streptococcusagalactiae,也称group BStreptococcus,GBS)最初是从乳腺炎患牛中分离的，故被称为无乳链球菌[1]。无乳链球菌是一种致病性极强的病原菌，在医学临床上不仅可以造成孕妇产妇产科疾病，如子宫内膜炎、早产、晚期流产，还能造成新生婴儿肺炎、败血症，甚至会引起脑膜炎[2]。有研究发现，无乳链球菌也会引起水产鱼类的脏器病变[3]，造成巨额损失。无乳链球菌也是引起奶牛乳腺炎的一种主要致病菌，它是一种专性乳腺寄生的高度接触传染性病原菌，主要引起隐性乳腺炎或部分临床型乳腺炎[4]。组织纤维化的发生是机体对损伤的一种修复反应，在组织损伤严重时，如果通过实质细胞的再生不能完全修复，常出现肉芽组织增生，并产生多量细胞外基质(ECM)，器官发生纤维化[5]。转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)不仅参与细胞的增殖、分化、凋亡、信号识别等生命活动，同时在胚胎发育过程中还可以诱导特定的器官发生。有研究证明，TGF-β1在肿瘤的发生和发展过程也起着重要作用[6]。研究发现，在TGF-β1作用下肺成纤维细胞可分化为肌成纤维细胞，通过TGF-β1/Smads信号通路参与肺纤维化的发生和发展[7]。同时，在肾脏纤维化启动和终止过程中TGF-β及其受体是发挥重要作用的关键细胞因子之一[8]。

目前对无乳链球菌的研究很多，却鲜有报道无乳链球菌对奶牛乳腺纤维化影响。本研究采用热灭活无乳链球菌作用于奶牛乳腺成纤维细胞，初步研究在奶牛乳腺纤维化过程中TGF-β1和TβRⅠ的相对表达量的变化，以探讨无乳链球菌感染与成纤维细胞TGF-β1和TβRⅠ表达的相互关系，为细菌性奶牛乳腺纤维化的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)，来源于前期课题培养、分离、鉴定、冻存的荷斯坦奶牛乳腺细胞[9]；无乳链球菌由内蒙古农业大学兽医学院药理组实验室提供[10]。DMEM/F12干粉培养基，Gibco公司产品；Trizol试剂(D910008A)、RT-qPCR扩增试剂盒(RR820A)、DNA Marker，TaKaRa公司产品；RNA反转录试剂盒(R122-01)，Vazyme试剂公司产品；小鼠β-actin抗体(ab6276)，Abcam公司产品；兔抗TGF-β1多克隆抗体，Millipore公司产品；兔抗TβRⅠ多克隆抗体(SC-399)，Santa Cruz公司产品；细胞裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、山羊抗鼠IgG-HRP及山羊抗兔IgG-HRP，碧云天生物技术研究所产品；无蛋白封闭液、预染蛋白Marker(26616)和ECL显影液(34095)，Thermo公司产品。

1.2 方法

1.2.1 热灭活菌液的配制 取出冻存的无乳链球菌菌种，在30℃、120 r/min摇床环境下复苏菌液，培养12 h。活化菌液2次后，采用琼脂平板活菌计数法检测菌液浓度。用无血清的DMEM/F12培养液，将菌液稀释至105、106、108CFU/mL[11]。70℃灭活30 min，血琼脂培养基鉴定没有菌落生长，即可作为处理菌液。

1.2.2 细胞准备和菌液作用 将复苏的BMFB传至6代～7代后，用0.5 g/L胰酶消化悬浮细胞，倒置显微镜下计数，按1×105/mL的密度接种于6孔细胞培养板中，待细胞培养板底部铺满单层细胞后，用无血清DMEM/F12培养液处理细胞24 h。对照组加入无血清的培养液，试验组加入不同浓度的热灭活无乳链球菌菌液(105、106、108CFU/mL)，分别培养6、12、24、48 h后收集细胞。

1.2.3 实时荧光定量PCR方法检测BMFB中TGF-β1和TβRⅠ mRNA的表达水平 按照TaKaRa RNAiso Plus操作说明书提取细胞总RNA。用酶标仪检测RNA的纯度和浓度，将RNA浓度统一调整为500 ng/μL，参照反转录试剂盒说明书进行反转录反应，将获得的cDNA置 -20℃保存备用。根据GenBank公布的β-actin、TβRⅠ和TGF-β1的序列，用 Primer 5.0 软件设计引物，由上海生物工程有限公司合成引物(表1)。β-actin和TGF-β1的扩增反应程序为：cDNA 95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，循环40次，熔解反应为60℃，1 min；TβRⅠ的扩增反应程序为：cDNA 95℃ 30 s，95℃ 5 s，55℃ 34 s，循环40次，熔解反应为65℃ 15 s。反应结束后，绘制终产物的熔解曲线，以β-actin为管家基因。

表1 引物序列及扩增参数

1.2.4 Western blot检测BMFB TβRⅠ和TGF-β1蛋白的表达 按“1.2.2”步骤处理细胞，根据细胞瓶中细胞生长的密度，每瓶加入250 μL裂解液，在冰上裂解10 min后，用刮刀刮取细胞，将裂解液全部吸到1.5 mL离心管中，4℃、12 000 r/min离心10 min。取上清液，用BCA法测定蛋白总浓度。根据抗体说明书上预测蛋白的大小，100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE) 电 泳。每上样孔的总蛋白量为25 μg，半干转法将条带电转移至聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上，50 g/L BSA 室温封闭2 h，一抗孵育16 h～18 h，4℃环境下过夜。一抗稀释比例见表2。HRP标记的二抗(1∶1 500)室温孵育1.5 h，按ECL超敏显色试剂盒说明书配置显色液，室温避光显色5 s～1 min，在凝胶成像仪中观察蛋白条带结果，以β-actin为内参。

表2 抗体稀释比例

1.2.5 统计学分析 实时荧光定量PCR结果数据处理采用2-ΔCt法，Western blot条带用Image J软件进行灰度值分析，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值表示蛋白相对定量结果。然后用SPSS22软件进行统计分析，各组内差异采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β-actin、TGF-β1和TβRⅠ引物特异性鉴定

以稀释后的cDNA作为模板，β-actin作为内参基因，对目的基因TGF-β1和TβRⅠ进行荧光定量PCR检测，根据扩增得到的Ct值绘制标准曲线。结果显示引物反应性良好，相关系数R2均大于0.99，具有良好的相关性(图1 A～图1C)。RT-PCR产物条带单一清晰，未见其他非特异性条带，产物片段与预计产物大小相一致(图2)。

2.2 对BMFB TGF-β1mRNA及其蛋白表达的影响

从图3结果可以看出，在各个时间点(6、12、24、48 h)，处理组(106CFU/mL、108CFU/mL)TGF-β1mRNA的表达量都高于对照组的(P<0.05)；在相同时间点，108CFU/mL热灭活无乳链球菌刺激的BMFB TGF-β1mRNA表达量最高；108CFU/mL刺激24 h时TGF-β1mRNA表达达到最大值。图4结果表明，处理组的TGF-β1蛋白表达水平显著高于对照组的，相同时间点，随着刺激浓度的增大，TGF-β1蛋白表达量升高；在24 h 106CFU/mL处理组蛋白表达量最大，108CFU/mL处理组蛋白表达水平明显降低；在48 h 105CFU/mL处理组蛋白表达量最大，106CFU/mL和108CFU/mL处理组蛋白表达水平明显降低；在12 h 106CFU/mL TGF-β1蛋白表达量达到最高峰(P<0.05)。

2.3 无乳链球菌对BMFB TβRⅠ mRNA及其蛋白表达的影响

图5结果表明，在各个时间点(6、12、24、48 h)，处理组(105、106、108CFU/mL)TβRⅠ mRNA的表达量均高于对照组的(P<0.05)；在相同时间点，除了12 h 106CFU/mL浓度下TβRⅠ mRNA表达量最高，其他时间点108CFU/mL浓度的热灭活无乳链球菌刺激的BMFB TβRⅠ mRNA 表达量最高；108CFU/mL热灭活无乳链球菌刺激48 h时 TβRⅠ mRNA表达达到最大。从图6结果可以看出，TβRⅠ处理组蛋白表达量均高于对照组的(P<0.05)，相同时间点，随着刺激浓度的增大，TGF-β1蛋白表达量升高；在各个时间点(6、12、24、48 h)，105CFU/mL处理组蛋白表达量最大；105CFU/mL热灭活无乳链球菌刺激24 h时达到峰值。

A.β-actin标准曲线及溶解曲线；B.TGF-β1标准曲线及溶解曲线；C.TβRⅠ标准曲线及溶解曲线

A.Standard curve and melting curve of β-actin; B.Standard curve and melting curve of TGF-β1; C.Standard curve and melting curve of TβRⅠ

图1 β-actin、TGF-β1及TβRⅠ标准曲线、熔解曲线

Fig.1 Standard curves and melting curves of β-actin,TGF-β1and TβRⅠ

M．DNA标准DL 500 ；1、2．阴性对照；3、4．β-actin；5、6．TGF-β1；7、8．TβRⅠ

M．DNA Marker DL 500 ；1,2．Negative control；3,4．β-actin；5,6．TGF-β1；7,8．TβRⅠ

图2 β-actin、TGF-β1和TβRⅠ的RT-PCR扩增产物条带

Fig.2 RT-PCR products of β-actin,TGF-β1and TβRⅠ

*．P<0.05较对照组；**．P<0.01较对照组

*．P<0.05 compared with control;**.P<0.01 compared with control

图3在不同作用时间点用不同浓度的无乳链球菌对BMFB TGF-β1mRNA相对表达量的影响

Fig.3 Effects of different concentrations ofStreptococcusagalactiaeon mRNA expressions of TGF-β1at differents time points in BMFB

*．P<0.05较对照组；**．P<0.01较对照组

*．P<0.05 compared with control;**.P<0.01 compared with control

图4在不同作用时间点用不同浓度的无乳链球菌对BMFB TGF-β1蛋白表达的影响

Fig.4 Effects of different concentrations ofStreptococcusagalactiaeon protein expressions of TGF-β1at different time points in BMFB

3 讨论

无乳链球菌进入乳腺造成组织损伤，炎性细胞浸润，会引起炎性细胞因子(如TNF-α、IL-1β)表达量升高[12]，这些因子会激活促纤维化的相关机制，导致ECM的积聚，最终引起纤维化。TGF-β1是炎症发生中的一种重要因子，与ECM的积聚紧密相关。毛忠懿等[13]在研究TGF-β1和整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)在大鼠肝纤维化中的表达试验中发现，随着肝纤维化的发展，TGF-β1表达程度随时间的延长呈明显递增趋势，表明大鼠肝组织纤维化与TGF-β1的表达相关。Tao Z[14]研究发现，TGF-β1与心肌梗死(myocardial infarction,MI)相关的心脏纤维化发展中起重要作用，通过葛根素抑制TGF-β1在心脏组织中的表达，从而显著的减弱心肌纤维化。本研究结果显示，热灭活无乳链球菌作用于体外培养的BMFB，TGF-β1mRNA和蛋白表达量都显著地升高。丁旭娜等[9]利用外源性 TGF-β1作用于BMFB，引起了乳腺成纤维细胞中α-SMA、CTGF和COLI α1 mRNA和蛋白的表达量升高，也表明了TGF-β1在奶牛乳腺纤维化中的重要性。

*．P<0.05较对照组；**．P<0.01较对照组

*．P<0.05 compared with control;**．P<0.01 compared with control

图5不同作用浓度无乳链球菌在不同作用时间对BMFB TβRⅠ mRNA表达的影响

Fig.5 Effects of different concentrations ofStreptococcusagalactiaeon mRNA expressions of TβRⅠ at different time points in BMF

*．P<0.05较对照组；**．P<0.01较对照组

*．P<0.05 compared with control;**．P<0.01 compared with control

图6不同作用浓度无乳链球菌在不同作用时间对BMFB TβRⅠ蛋白表达的影响

Fig.6 Effects of different concentrations ofStreptococcusagalactiaeon protein expressions of TβRⅠ at different time points in BMFB

TGF-β1的受体有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3种类型。TβRⅠ又称活化素受体样激酶(actin receptor-like kinase，ALK)，它在纤维化中发挥着至关重要的作用。有研究显示，在大鼠心肌梗死模型中，利用阻断剂阻断TβRⅠ后，会明显减轻心肌梗死后的左心室重塑和心肌收缩功能障碍[15]，TβRⅠ可能是心肌梗死后心肌重塑过程中的关键调节分子之一[16]。Wang B等[17]等研究证明，靶向抑制肾脏细胞TβRⅠ的表达可以有效抑制肾脏的纤维化。冀红等[18]的博来霉素致大鼠肺间质纤维化试验中，对TβRⅠ的3种亚型(ALK4、ALK5、ALK7)进行了研究，结果表明ALK4、ALK5和ALK7均在肺间质纤维化的发生发展过程中存在高表达。也有研究发现，TβRⅠ在mRNA和/或蛋白水平上的表达降低或缺失可能引起肿瘤的发生[19]。本研究结果显示，热灭活的无乳链球菌作用于体外培养的BMFB时，TβRⅠ mRNA和蛋白表达量都显著升高，说明无乳链球菌能促进BMFB TβRⅠ mRNA和蛋白的表达。

在自然情况下，合成和分泌的TGF-β1是没有生物活性的，只有与TβRⅠ和TβRⅡ结合后，激活TβRⅠ的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，活化TβRⅠ，才能最终启动TGF-β/Smad通路。TβRⅠ磷酸化激活细胞内的Smad2、Smad3 蛋白，Smad2、Smad3 蛋白与Smad4 结合形成一个寡聚复合物进入核内，将信号从胞质转导到细胞核，调控下游基因的转录和表达[20]。Meng X M等[21]研究发现，在肾纤维发生过程中， Smad3和Smad7之间的平衡移动会导致肌成纤维细胞的积累和活化，ECM的过量产生和患病肾中ECM降解的减少。TGF-β/Smad信号通路可在膜受体、细胞内信号分子和核内基因水平等多个层次发生复杂的交互调节，调控纤维化的发生发展[22]。

在本课题组前期的研究结果中，吴建美[11]关于金黄色葡萄糖球菌对奶牛乳腺成纤维细胞TGF-β1表达和王一[23]关于大肠埃希菌对奶牛乳腺成纤维细胞TGF-β1表达都有明显的升高。Gao Y等[24]采用外源性TGF-β1作用乳腺成纤维细胞和小鼠乳腺基部注射外源性TGF-β1的方法，证实TGF-β1通过ERK1/2信号通路显著促进奶牛乳腺成纤维细胞外基质α-SMA和Collagen-I表达，在小鼠乳腺组织上进一步验证发现TGF-β1能显著促进乳腺组织纤维化的发生。杨彬等[25]等研究表明，BMFBs在热灭活金黄色葡萄球菌刺激下能够显著促进TGF-β1mRNA和α-SMA、Collagen-I、p-Smad2/3的蛋白质表达，提示金黄色葡萄球菌可能通过TGF-β1/Smad信号通路诱导奶牛乳腺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞。以上研究结果都表明了TGF-β1对乳腺纤维化的重要作用。本研究证明热灭活的无乳链球菌可以促进体外培养的成纤维细胞中TGFβ1和TβRⅠ的mRNA及蛋白的表达，对于无乳链球菌通过何种途径引起TGF-β1及其受体的表达，最终引起纤维化有待进一步研究。

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Abstract:In order to investigate the effects of different concentrations of heat-inactivatedStreptococcusagalactiaeon the expressions of transforming growth factor β1(TGF-β1) and its receptor TβRⅠ in bovine mammary fibroblasts (BMFB),6 or 7 generations of culturedinvitroBMFBs were exposed to the serum-free medium and the heat-inactivated GBS at different concentrations (105,106,108CFU/mL),respectively,and the total RNA and proteins were extracted from the cells after 6，12，24 and 48 hour,respectively.The mRNA expressions of TGF-β1and TβRⅠ were detected by real-time fluorescence quantitative PCR,The protein expressions of TGF-β1and TβRⅠ were detected by Western-blot.Compared with the control group,the mRNA expression of TGF-β1was significantly elevated when BMFB were exposed to GBS,and reached the maximal levels at 24 h(P<0.05).The protein expression of TGF-β1reached the maximal levels at 12 h,and then the expression went down at 24 h(P<0.05).The expression of TβRⅠ mRNA was higher than that of the control group,and reached the maximal levels at 48 h (P<0.05).The expression of TβRⅠ protein at 12 h was lower than that at 6 h,and reached the maximal levels at 48 h,and then the expression went down (P<0.05).The preliminary study confirmed that heat-inactivatedStreptococcusagalactiaecould promote the expressions of TGF-β1and TβRⅠ mRNA and protein in BMFBs.

Keywords: heat inactivated;Streptococcusagalactiae; bovine mammary fibroblasts; transforming growth factor β1; TβRⅠ

EffectofHeatInactivatedStreptococcusagalactiaeonexpressionsofTGF-β1andTβRⅠinBMFB

ZHANG Rui-jin,DING Yu-lin,BI Yan-nan,ZHAO Mi,GUO Yun-ze,WANG Feng-long

(CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,InnerHohhot,Mongolia,010018,China)

S852.611

A

1007-5038(2017)08-0007-07

2017-01-12

国家自然科学基金项目(31460642)

张芮今(1989-) ，男，内蒙古赤峰人，硕士研究生，主要从事动物传染病与免疫病理学研究。*