多肉植物白牡丹Graptoveria ‘Titubans’组培快繁技术

管菊　万劲　陈嘉裔

摘要：以白牡丹叶片及幼嫩茎段为外植体，建立无菌快繁体系，在此基础上筛选适合白牡丹组培快繁不同生长阶段的最适培养基。结果表明：最适宜的外植体材料为叶片，灭菌方法为75%乙醇处理15 s、0.1% HgCl2处理12 min；最佳的丛生芽诱导培养基为MS+2 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA，芽诱导量可达10.8个/张；最适增殖培养基为 MS+0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA+1 mg/L KT，增殖倍数可达11.57；使用切根苗于干燥基质上进行生根炼苗可取得较好效果，炼苗成活率可达95%。

关键词：多肉植物；白牡丹；组织培养

中图分类号： S682.330.4+3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）14-0036-03

白牡丹（Graptoveria ‘Titubans）由景天科石莲花属多肉植物静夜（Echeveria derenbergii）与风车草属胧月（Graptopetalum paraguayense）杂交培育而来，是目前较为流行的多肉园艺品种之一。白牡丹茎叶肉质化，全株被白粉，互生叶排列成莲座形，如牡丹花绽放，具有很高的观赏价值[1]。白牡丹繁殖方式目前仅局限于扦插以及分株繁殖，白牡丹规模繁殖一直存在技术瓶颈。因此，对于白牡丹组培快繁技术进行研究具有一定意义，本研究将为白牡丹组培扩繁提供试验依据。

1材料与方法

1.1试验材料

试验材料为西南林业大学大棚内种植的多肉植物白牡丹。选取的外植体分别为白牡丹植株的叶片、茎段。

1.2试验方法

1.2.1培养条件本试验采用MS为基本培养基，附加 0.4% 1 500 g/cm2强度卡拉胶、30 g/L蔗糖，pH值调节至 5.8～6.0，121 ℃高压灭菌锅中灭菌15 min备用。选用日本三洋MLR-351H型培养箱进行组织培养，光照度设定为 3 000 lx，设定每天的光照时间为18 h，培养温度为25 ℃。

1.2.2材料与消毒选取长势良好的植株茎段与叶片为供试材料。叶片要求为从基部与茎段分离的完整叶片，叶片饱满挺拔、表面无伤痕；茎段要求为当年生幼嫩茎段，表面无伤痕、无虫害。剪取材料后，将材料首先置于洗衣粉中浸泡约10 min，在浸泡过程中，用软毛刷轻轻刷洗，将材料表面残留的污物清除；之后再将材料置于流水中冲洗，冲洗约3 h，冲洗完成后，将材料置于超净台内，用75%乙醇快速浸泡15 s；取出后立即置于无菌水中清洗，再用0.1% HgCl2消毒，设置4、8、12、16 min 4个时间梯度的消毒处理，之后用无菌水清洗 5～6次，总清洗时间不少于15 min；将清洗后的材料置于灭菌滤纸上吸去多余水分，接种入MS空白培养基中，每瓶接种1株，每个处理20瓶，3次重复。3 d后开始记录污染率、污染类型、死亡率，之后每天记录1次，15 d后结束记录。

1.2.3诱导培养以MS为基本培养基，分别附加不同含量的NAA、6-BA（表1），使用之前试验中所得的最适外植体材料以及最适消毒方法，将外植体接种于分别附加不同激素含量的培养基中，每种处理接20瓶，每瓶接种1株，重复3次，30 d后统计诱导情况。

1.2.4增殖培养根据初代培养中白牡丹无菌苗诱导培养的长势情况，确定白牡丹无菌苗的增殖培养方式。将初代培养中诱导得到的白牡丹丛生芽或愈伤组织接种于以MS为基本培养基，分别附加不同含量NAA、6-BA、KT的培养基中，进行增殖培养，采用L9（34）正交试验设计（表2、表3），每种处理接20瓶，每瓶接种3株，重复3次，30 d后统计增殖情况。

1.2.5生根培养与炼苗移栽采用1/2MS培养基进行生根培养，当植株长至4～5 cm时进行炼苗移栽。炼苗基质采用椰糠+珍珠岩以1 ∶[KG-*3]1体积比例混配，121 ℃高压蒸汽灭菌对基质进行消毒。由于景天科植物生根较为容易，故分别选取未经生根培养、经过生根培养且根长为4～5 cm的2种材料进行炼苗培养。先将瓶口打开，逐渐与外界环境接触，提高种苗的适应能力，5 d后将小苗取出，在自来水下用镊子、软毛刷等洗净附着在根部的培养基，种于含水量不同的基质中（表4），每个处理接种20株苗，3次重复，保持空气湿度在70%以上，30 d后统计成活率及根系情况。

2结果与分析

2.1不同植物器官及不同HgCl2消毒时间对外植体成活率的影响

表5显示，随着HgCl2消毒时间的增加，污染率大幅度降低，这说明使用HgCl2处理对材料表面所携带的污染物具有较好的灭杀效果；但是随着HgCl2处理时间的延长，植物成活率明显降低，说明过长时间的HgCl2接触会对白牡丹外植体造成较大伤害。

不同植物器官用HgCl2处理的效果也是不同的，使用茎段作为外植体时，大部分处理成活率要低于以叶片为外植体的处理组，这说明相比茎段，叶片更适宜作为外植体。同时，使用茎段作外植体时，3 d后的污染率仍然在不断上升，与 15 d 时相比，各处理的污染率上升幅度均大于以叶片为外植体的处理组，这一现象可能与茎段上存在灭菌死角、自身所带的内生菌较多有关，也进一步说明了相比茎段，叶片更适宜作为外植体。

综合白牡丹生长特性，由于白牡丹自身生長速度缓慢，难以取得如花茎这类内生菌相对较少的外植体材料，故较适的外植体材料为叶片，最佳消毒处理方法为采用75%乙醇处理15 s、0.1% HgCl2处理12 min。

2.2不同培养基下无菌苗的诱导培养

表6显示：使用白牡丹叶片为外植体，在合适培养基配方下叶片即可以直接诱导出大量丛生芽。在试验中发现，NAA与6-BA含量比值与丛生芽的发生有密切关联，6-BA含量范围为1～3 mg/L时，当6-BA/NAA值<10，则大部分叶片开始只生根不长芽，最终叶片死亡；当6-BA/NAA>10时，大部分叶片逐渐开始发生膨大，最终形成水渍状的愈伤组织；6-BA/NAA值=10时，丛生芽诱导效果最好。当6-BA含量为2 mg/L、NAA含量为0.2 mg/L时，白牡丹丛生芽诱导效果最好，在灭菌接种约8 d时，叶片首先出现一定膨大，部分区域发生开裂，可见内部嫩绿色膨大组织；之后15 d左右时，在近基部的叶片区域以及叶片开裂的区域内，萌发出大量丛生芽，丛生芽平均萌发量达10.8芽/张，诱导效果良好。endprint

2.3不同培养基下无菌苗的增殖培养

由表7可见，第3组处理2 mg/L 6-BA+2 mg/L KT的增殖倍数最高，但增殖长势最差，出现了严重的玻璃化现象，导致之后无法正常继代生长，故此配方不具备可行性；而在第1组不添加激素的培养基中，丛生芽长势最好，说明此培养基适合作为白牡丹的壮苗培养基使用，在出现丛生芽长势变差、需要壮苗生根时，可选用此配方。综合各组增殖倍数以及长势来看，第9组0.2 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA +1 mg/L KT为最佳增殖培养基处理，在此激素组合下丛生芽有较高的增殖倍数，在长势上也较为良好，利于转接继代。

由表8可以看出，KT、6-BA在0.05水平下影响显著，说明这2种激素在丛生芽增殖时与增殖倍数有着较大相关性，而KT影响度相较于6-BA更大，说明KT对于白牡丹丛生芽的增殖倍数较6-BA更为敏感。NAA对丛生芽增殖倍数影响较小，结合丛生芽增殖长势，NAA含量可能与维持丛生芽正常形态有关，通过配合NAA的添加，使得丛生芽在高速增殖的同时仍然保持一定的正常长势，避免出现玻璃化现象。

2.4炼苗移栽

白牡丹的炼苗与常规组培苗炼苗区别较大。首先，组培苗所产生的根系在炼苗过程中难以存活，这表明在白牡丹快繁过程中不宜进行瓶内生根。此外，在白牡丹的炼苗过程中进行保湿处理并不利于其生长，而相对干燥的环境更加利于白牡丹新根的萌发及存活。组培苗切根后移栽于保持湿润的介质中，大部分植株在8 d左右时切口处即发生溃烂，导致植株死亡。由表9可见，带根的组培苗在保持湿润的介质中始终无明显变化，30 d内未见新根形成，且有部分组培苗出现溃烂死亡。带根的组培苗移栽于干燥介质中，虽然根系很快出现死亡，植株出现了萎蔫现象，但大部分植株在25 d左右后即出现了新根并存活下来，只有少部分植株死亡。将组培苗切根后移栽入保持干燥的介质中，相比以上几组植株成活情况好，植株移栽后在12 d时即见新根产生，炼苗成活率可达95%。

3结论与讨论

不同多肉植物，根据自身特性的不同，可以用不同的诱导方式以及增殖手法来进行组培扩繁。在实际操作中，需要视无菌苗生长情况进行科学选择，如大和锦、玉露、十二卷、寿等这些多肉，首先需要通过诱导形成绿色球状小体或愈伤组织，再来诱导产生丛生芽[2]。本试验中的白牡丹，在对叶片进行诱导时直接就可以诱导出丛生芽，通过对丛生芽的增殖培养，即可获得高效增殖扩繁体系，若对其进行愈伤诱导培养反而影响了其增殖进程，没有太大意义。

在增殖培养中，经过方差分析发现，白牡丹丛生芽增殖倍数与KT、6-BA显著相关，而NAA虽然与增殖倍数无显著相关，但与丛生芽形态关联密切，丛生芽在NAA与KT、6-BA组合下达到最优繁殖水平，这与宋晓涛等的研究结论[3-4]基本一致，但夏时云等在对龟甲龙的增殖培养中，使用NAA与KT的组合配方也取得良好繁殖[5]。同时，本研究中KT与增殖倍数的相关性较6-BA高，这说明有可能仅使用KT的效果也会较好，这还有待进行验证。

在对多肉植物的炼苗过程中，常规的保湿条件并不利于多肉的炼苗与移栽。在相对干燥的情况下，白牡丹植株不但没有出现萎蔫枯死的现象，反而有利于新根的萌发，这与多肉植物平时的养护种植有一定类似[6]，在常规繁殖中，也是相对干燥的环境更有利于根系产生及植株生长，这可能是由多肉植物原本的生境以及自身的一些特性所決定的，具体是哪些因素造成的，也有待进一步研究。

参考文献：

[1]丁一凡，刘宇，刘娅妮，等. 银川地区景天科多肉花卉新品种形态特征与栽培管理初报[J]. 农业科学研究，2015，36（2）：86-90.

[2]孙涛，金蕊，李德森. 康平寿的组织培养与快速繁殖[J]. 植物生理学通讯，2003，39（3）：232-232.

[3]宋晓涛，沈萌，左志宇，等. 十二卷属植物西山寿的组织培养与快速繁殖[J]. 植物生理学通讯，2007，43（5）：883-884.

[4]张昊鹏，宋晓涛，张耀，等. 白银寿的组织培养与快速繁殖[J]. 植物生理学通讯，2008，44（5）：951-952.

[5]夏时云，孙涛，李德森. 龟甲龙的组织培养与快速繁殖[J]. 植物生理学通讯，2004，40（5）：589-589.

[6]胡海波，郝永丽，高博，等. 多肉植物繁殖特性概述[J]. 农业工程技术，2016，36（1）：64-67.endprint