土壤中茄科雷尔氏菌实时荧光定量PCR快速检测体系的建立与应用

张海燕　张小芳　魏兰芳

摘要：根据茄科雷尔氏菌eg1基因，设计1对特异性引物，建立并优化实时荧光定量PCR反应体系，并对土壤中的茄科雷尔氏菌进行检测和评估。对采自云南省文山州5个县的100份青枯病带菌土壤进行检测，结果表明，100份土壤样品中，广南县15、22、24号，丘北县31、35、43号，麻栗坡县62、67、68号，马关县70、74、78、79、80、83、84号，共16份土壤样品中茄科雷尔氏菌含量大于105 CFU/mL，预测细菌性青枯病发病风险较高；广南县12、20、21、23、26、27、29号，丘北县30、33、34、37、38、39、46、48号，麻栗坡县50、52、54、58、59、60、61、63、64、65、66、69号，马关县71、72、73、75、76、77、81、82、85、86号，砚山县1、2、4、5、7、9号，共43份土壤样品检测出的茄科雷尔氏菌含量在104～105 CFU/mL之间，预测细菌性青枯病发病风险中等；其他土壤样品检测出的茄科雷尔氏菌含量均小于103 CFU/mL，预测细菌性青枯病发病风险低，其中砚山县3、10、87、88、89、90号，广南县14、19、25、28、91、92、93号，丘北县32、36、44、49、94、95、96号，麻栗坡县51、57、97、98、99、100号，共26份土壤样品中未检测出茄科雷尔氏菌。

关键词：茄科雷尔氏菌；实时荧光定量PCR检测；快速检测体系；细菌性青枯病

中图分类号： S432.4+2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）14-0017-03

茄科雷尔氏菌[Ralstonia solanacearum （Smith） Yabuuchi et al.]是世界上最重要的植物病原细菌之一，广泛分布于热带、亚热带及温带地区。该病原细菌的寄主范围较广，可侵染55科数百种植物[1]。在我国，已报道有番茄、辣椒、茄子、马铃薯、烟草、花生、生姜、沙姜、桑、蕹菜、桉树等10余种作物受到该病原细菌的危害，造成细菌性青枯病。该病原菌主要在土壤中及遗落土中的病株残体上越冬，通过根部﹑叶柄或茎部的伤口侵入后，在维管束内繁殖，并沿维管束向上发展，以致维管束阻塞，腐烂变褐，茎、叶因得不到水分、养分的供应而萎蔫[2]。调查研究表明，由该病原菌造成的烟草青枯病极为严重，给我国西南地区及长江下游流域的烟草生产带来了很大威胁[3]。其中个别年份烟草青草枯病暴发流行，发病重的地塊，产量损失达 80%左右，造成毁灭性损失[4]。此外，受该病原菌感染的番茄、茄子、辣椒等茄科作物的产量会大幅减少，带来严重的经济损失[5-7]。因此，对温室或大田可能存在的病菌进行早期检测，对于适时控制病害的发生有着极为重要的意义。

近年来，随着分子生物学技术的快速发展，实时荧光定量PCR技术在植物病害研究上也不断深入并广泛在多种病原菌定量检测中应用，极大地提高了植物病害的检测效率[8-11]。Nicholson等利用实时荧光定量技术建立了小麦茎基部病原物的定量检测方法[12]；潘娟娟等利用 RT-PCR 技术建立了定量检测小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）潜伏侵染的方法，对小麦条锈病进行早期检测，指导病害的预测[13-14]。目前，国内外未有利用该方法对茄科雷尔氏菌进行检测的报道，本研究拟查阅文献并分析茄科雷尔氏菌基因序列的保守区，设计相关的荧光定量PCR的特异性引物，并应用建立的方法对采自云南省各个地区土壤中的病原菌进行早期检测。

1材料与方法

1.1试验材料

茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）标准菌株Y45，由云南省农业科学烟草研究院提供；软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum）MY9，由笔者实验室保存；细菌基因组DNA提取试剂盒（BioTeke），购自生工生物工程（上海）股份有限公司；土壤DNA提取试剂盒（美国MO BIO），购自北京宝杰罗生物科技有限公司；PCR引物由宝生物工程（大连）有限公司合成；TaKaRa SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）试剂盒，购自宝生物工程 （大连） 有限公司；荧光定量PCR仪器（BIO-Rad IQTM5），由云南农业大学生物多样性国家工程中心提供。

云南省文山州5个县（广南县、丘北县、麻栗坡县、马关县、砚山县）的100份土壤样品，由云南省文山州烟草公司协助采集。

1.2试验方法

1.2.1茄科雷尔氏菌标准菌株DNA提取与检测使用细菌基因组DNA提取试剂盒（BioTeke）提取茄科雷尔氏菌标准菌株Y45的DNA，于微量分光光度计下检测DNA浓度及D260 nm/D280 nm值，-20 ℃保存备用。

1.2.2土壤DNA提取与检测使用土壤DNA提取试剂盒（美国MO BIO）进行土壤中烟草青枯病病菌基因组DNA的提取，具体操作步骤参照试剂盒说明书。提取结果经1%琼脂糖凝胶电泳检查。Nano Drop 2000超微量分光光度计检测土壤总DNA浓度和纯度，-20 ℃保存备用。

1.2.3引物设计与合成使用PrimerPremier 5.0，根据GenBank中茄科雷尔氏菌eg1基因部分序列设计1对引物 RS-1：5′-GTGCCTGCCTCCAAAACGACT-3′；RS-2：5′-GACGCCACCCGCATCCCTC-3′，PCR引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2.4引物特异性检测以茄科雷尔氏菌标准菌株Y45的DNA为模板，标准菌株Y45的基因组DNA为阳性对照，软腐果胶杆菌MY9的DNA为阴性对照，ddH2O为空白对照，应用引物RS-1、RS-2进行普通PCR 和RT-PCR扩增，检测引物特异性。endprint

茄科雷尔氏菌普通PCR反应体系：2.5 μL Buffer，2.0 μL dNTP Mix，引物RS-1、RS-2各0.5 μL，1.0 μL Taq Enzyme，25 μL DNA模板，ddH2O补足25.0 μL。反应条件：95 ℃预变性1 min；94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，凝胶成像系统分析试验结果。

茄科雷尔氏菌RT-PCR反应体系：引物RS-1、RS-2各0.5 μL，12.5 μL SYBR Premix Ex Taq，2.0 μL DNA模板，ddH2O补足20.0 μL。

1.2.5RT-PCR标准曲线的建立及引物灵敏度检测取茄科雷尔氏菌Y45的DNA，并将DNA进行梯度稀释，即取 10 μL DNA加入到90 μL ddH2O中，把DNA的浓度稀释成10-1，并依次稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，以ddH2O为空白对照，RT-PCR反应体系参照“1.2.4”节中青枯病菌 RT-PCR的反应体系。

1.2.6土壤样品中茄科雷尔氏菌的荧光定量PCR检测反应体系参照“1.2.4”节中青枯病菌RT-PCR的反应体系。

2结果与分析

2.1引物特异性检测结果

用所设计的引物 RS-1、RS-2 对茄科雷尔氏菌标准菌株Y45的DNA进行PCR扩增，结果（图1）表明，仅茄科雷尔氏菌Y45菌株基因组DNA能扩增出290 bp的特异性条带，与预测结果一致。说明所设计的引物具有特异性，能够区别于其他病原菌。

2.2土壤样品中青枯病菌的荧光定量PCR检测结果

由表1可知，100份土壤样品中，广南县15、22、24号，丘北县31、35、43号，麻栗坡县62、67、68号，马关县70、74、78、79、80、83、84号，共16份土壤样品中检测到的茄科雷尔氏菌含量较高（大于105 CFU/mL），预测细菌性青枯病发病风险较[CM（25]高；广南县12、20、21、23、26、27、29号，丘北县30、33、34、37、38、39、46、48号，麻栗坡县50、52、54、58、59、60、61、63、64、65、66、69号，马关县71、72、73、75、76、77、81、82、85、86号，砚山县1、2、4、5、7、9号，共43份土壤样品中检测出的茄科雷尔氏菌含量在104～105 CFU/mL之间，预测细菌性青枯病发病风险中等；其他土壤样品检测出的茄科雷尔氏菌含量均小于103 CFU/mL，预测细菌性青枯病发病风险低，其中砚山县3、10、87、88、89、90号，广南县14、19、25、28、91、92、93号，丘北县32、36、44、49、94、95、96号，麻栗坡县51、57、97、98、99、100号，共26份土壤样品中未检测出茄科雷尔氏菌。

3讨论

茄科雷尔氏菌（R. solanacearum）是一种危害严重的土传病害病原菌，具有非常广泛的宿主范围，在世界各地均有分布[15]，其中以茄科中的寄主种类最多，茄科雷尔氏菌可以引起茄科作物上重要的细菌性病害，在严重发生的年份甚至造成绝收[16]。因此，在发病前快速、准确地检测田间土壤中茄科雷尔氏菌的数量和动态变化规则能为该病的测报、防治策略或防控措施的制定和应用，以及品种田间抗性评价提供重要的科学依据[17]。

传统的茄科雷尔氏菌检测方法存在检测周期长、操作复杂、灵敏度不高等缺点，不能较好地满足检测工作的要求。随着分子生物学技术的发展，实时荧光定量PCR技术具有快速、灵敏度高、特异性强的特点，可高通量定量检测土壤中病原菌数量，可提前对烟草等茄科细菌性青枯病发生风险进行评估，已经广泛运用于多种土传病原菌的快速检测研究领域中[18]。本研究中建立的茄科雷尔氏菌的实时荧光定量PCR快速检测体系，为该病原菌的快速检测提供了新的方法，且能够实时监测作物病害发生发展过程中病原菌的动态变化，为病原菌的预测预报及病害防控奠定了基础。

4结论

本研究利用实时荧光定量PCR建立了茄科雷尔氏菌的快速检测技术体系，并用该方法对来自云南省文山州5个县的100份土壤样品进行了检测，16份土壤中茄科雷尔氏菌总数均大于105 CFU/mL，预测细菌性青枯病发生风险较高；43份土壤样品检测出的茄科雷尔氏菌含量在104～105 CFU/mL之间，预测细菌性青枯病发病风险中等；15份土壤样品检测出的茄科雷尔氏菌含量均小于103 CFU/mL，預测细菌性青枯病发病风险低；其余26份土壤样品中未检测出茄科雷尔氏菌。

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