糠醛缩壳寡糖席夫碱及Cu(Ⅱ)配合物与DNA之间的作用机制

李小芳， 冯小强， 朱元成

(天水师范学院 化学工程与技术学院， 甘肃 天水 741001)

糠醛缩壳寡糖席夫碱及Cu(Ⅱ)配合物与DNA之间的作用机制

李小芳， 冯小强*， 朱元成

(天水师范学院 化学工程与技术学院， 甘肃 天水 741001)

以糠醛和壳寡糖反应生成的席夫碱，与不同摩尔比的Cu2+配位合成配合物FCOS-Cu11、FCOS-Cu13和FCOS-Cu31，并研究配合物与DNA之间的作用机制。采用循环伏安、紫外-可见吸收光谱、粘度和DNA熔点测定的方法，分别研究了席夫碱及配合物与DNA之间的作用机制。合成的3种配合物具有电化学活性。加入DNA后，配合物的氧化峰电流减小，峰电位微弱移动。配合物的吸收峰强度减色显著，同时伴有峰位红移现象。配合物加入后，DNA的相对粘度和熔点呈增大趋势。结果表明，席夫碱及配合物与DNA之间存在嵌插结合，且3种配合物中的Cu2+含量与DNA的嵌插作用强度有关，结合强度依次为FCOS-Cu11>FCOS-Cu13> FCOS-Cu31。

席夫碱； 配合物； 结合DNA

Abstract: Schiff base was synthesized by the reaction of oligochitosan with furfuraldehyde, and acted it as ligand to prepare different molar Schiff base copper complexes which possessed electrochemical activity. The action mechanism of the complex and DNA was studied by spectrometry, viscosity measurement, cyclic voltammeiry and melting point experiment. The results indicate that the reaction of central Cu2+at glassy carbon electrodes is controlled by diffusion process mechanism. The intensity of the maximal absorption peaks of the complexes is weakened with the increasing of DNA concentration, and the oxidation peak current is decreased but no new redox peak appeared. At the same time, the viscosity and melting point of DNA are increased. There are intercalation action between the complex and DNA, and DNA-binding ability order is FCOS-Cu11>FCOS-Cu13>FCOS-Cu31.

Keywords: Schiff base; complex; DNA binding

1 引 言

席夫碱是一类具有良好的配位能力和优良生物活性的化合物，近年来对席夫碱铜配合物的杀菌、抗菌、抗癌活性研究颇多，如李桂芝等[1]发现含硫席夫碱及其铜配合物对大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌的杀菌活性优于配体；毕思玮等[2]发现氨基酸系列水杨醛席夫碱与铜配合物的抗菌活性随配体中氨基酸残基非配位基因R的增大而减小，这说明随稳定性的提高，抗菌活性减小；唐婷等[3]发现缩胺、缩胺基脲、缩胺基酸3类席夫碱的铜配合物对大肠杆菌的抑制能力较配体强。但是，某些席夫碱的毒副作用极大程度上限制了其应用，在提高活性的同时必须有效降低毒副作用是研究者关注的问题。

抗肿瘤药物发挥药效与脱氧核糖核酸(DNA)的嵌插键合方式及作用程度有关。一些抗肿瘤药物能够嵌插到DNA碱基对中而起药理作用。研究药物与DNA之间的作用机制，对通过分子设计筛选有效治疗药物具有十分重要的意义。壳寡糖(简称COS)是由壳聚糖解聚而成的低分子壳聚糖,天然无毒、水溶性好, 具有广谱及高抑菌活性、消炎抗病毒、止血、降酯和胆固醇的作用，而且可通过活化免疫系统抑制肿瘤细胞显示抗癌活性[4]。有关壳聚糖及衍生物与DNA相互作用的研究颇多，如齐炎等采用光谱法研究了壳聚糖季铵盐与小牛胸腺DNA的作用，发现两者主要以嵌插方式结合，使得DNA双螺旋结构更紧密[5]；张海容等采用光谱法和碱变性曲线等方法研究了不同取代度硫酸酯化壳聚糖与DNA的相互作用机理，发现硫酸酯化壳聚糖与荧光探针DNA/EB的作用存在嵌插和静电作用两种模式，硫酸酯化壳聚糖是一种有希望的基因治疗靶向分子[6]。

我们前期研究了羧甲基壳聚糖金属配合物(Cu,Cr,Ag,Co)[7-10]以及丁二酰化壳寡糖稀土配合物[11]与鲱鱼精DNA的作用机制。基于以上所述，我们以糠醛和壳寡糖反应生成的席夫碱为配体，和不同摩尔比的Cu2+配位得到系列配合物，并研究了席夫碱及配合物与DNA之间的结合方式。该研究工作可以对诊断治疗与DNA有关疾病的药物设计提供理论依据。

2 实 验

2.1 试剂与仪器

糠醛(分析纯，天津市化学试剂二厂)，氯化铜(分析纯，西安化学试剂厂)，壳寡糖(相对分子质量<5 000，济南海得贝海洋生物工程有限公司)，鲱鱼精DNA(Sigma公司产品)。

UV-2450型紫外-可见分光光度计(日本岛津)，CHI660B型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)，Sp-752紫外可见分光光度计(上海光谱)。

2.2 席夫碱及Cu(Ⅱ)配合物的制备

2.3 配合物与DNA之间的作用

采用循环伏安法、紫外-可见吸收光谱、粘度和DNA熔点测定的方法，研究了配合物与DNA之间的作用机制，具体实验方法参见文献[12-13]。

3 结果与讨论

3.1 循环伏安法

设定扫描速率为0.6 V/s， 在-0.6～1.2 V电位范围内发现FCOS没有任何氧化还原峰，而3种配合物都在玻碳电极表面的氧化反应速率较大，但出现的还原峰都很弱，其中FCOS-Cu11在0.074 V和0.448 V处有两个氧化峰，FCOS-Cu13在0.268 V处有一个氧化峰，FCOS-Cu31在0.121 V和0.271 V处有两个氧化峰，表明FCOS与Cu2+参与了配位反应，生成的配合物都具有电化学活性。当扫描速度增加时，FCOS-Cu11、FCOS-Cu13和FCOS-Cu31的氧化峰电位Ep都发生了正移，并且氧化峰电流Ip呈现增强趋势，如图1所示。通过作图发现FCOS-Cu11、FCOS-Cu13和FCOS-Cu31的氧化峰电流与扫描速度之间存在线性关系，线性方程依次为：Ipa(10-5A)=-1.01-7.58v(R=0.999)、Ipa(10-5A)=-2.25-11.72v(R=.992)和Ipa(10-5A)=-3.14-9.84v(R=0.994)，如图2所示，表明配合在玻碳电极上的反应由吸附过程控制 。

图1 扫速速率对不同配比FCOS-Cu循环伏安曲线的影响

Fig.1 Effect of scan speed rate on CV curves of FCOS-Cu

加入DNA后，FCOS-Cu11在0.074 V的氧化电位负移了56 mV，峰电流下降2.336×10-5A，而在0.448 V处的氧化峰并没有发生位移，峰电流下降3.172×10-5A；FCOS-Cu31在0.121 V和0.271 V处的氧化电位，分别正移了3 mV和58.7 mV，电流分别降低了6.05×10-5A和1.14×10-5A；FCOS-Cu13在0.268 V的氧化电位负移了0.120 7 V，电流降低了4.215×10-5A，如图3所示。峰电流的降低可能是由于配合物分子与DNA分子发生了键合作用，使得溶液中自由配合物分子数减少，导致氧化还原峰电流减小[14-15]。3种配合物在加入DNA后都有电流减小的趋势，同时峰电位有微弱的移动，这就说明配合物与DNA之间发生了作用。

图2 Ip～v的关系式

图3 配合物与DNA相互作用的循环伏安图

3.2 紫外光谱法

在配合物中分别滴加300 μL DNA后，配合物的紫外可见吸收光谱发生了显著的改变，其中FCOS原位于275.2，224，200.2 nm的吸收峰，峰位分别发生红移(红移了11.4 nm，强度减色34.5%)、不变和消失，并在261.8 nm出现新吸收峰；FCOS-Cu31原位于271.6 nm和200.4 nm的吸收峰，峰位分别红移了5 nm和19 nm，对应的吸收强度分别增色93.46%和减色23.91%；FCOS-Cu11原位于273.8 nm和202.6 nm的吸收峰，峰位分别红移4.6 nm和17 nm，对应的吸收强度分别增色37.4%和减色39.8%；FCOS-Cu13原位于271.6 nm和204.6 nm的吸收峰，峰位分别红移5.6 nm和17.2 nm，对应的吸收强度分别增色114.7%和减色32.7%，如图4所示。已有文献报道，如果小分子与DNA之间存在嵌插作用，DNA加入后使小分子的吸收光谱发生红移现象和减色效应[16]。紫外可见吸收光谱图的变化说明了席夫碱及3种配合物都以嵌入方式和DNA作用。此外，吸收强度降低的程度与药物分子插入DNA的程度呈正相关，吸收强度降低的越明显，说明插入程度越强。从图4可以看出，在同浓度配合物中滴加同浓度的DNA时，FCOS-Cu11配合物的强度降低程度最大，FCOS-Cu13次之，表明配合物与DNA之间的结合强度依次为FCOS-Cu11>FCOS-Cu13>FCOS-Cu31。

c(DNA)=0.1 g/L (100 μL per scan, 1～4： 0～300 μL)

3.3 粘度法

不同浓度的糠醛席夫碱及配合物对DNA粘度的影响如图5所示。随着糠醛席夫碱及配合物浓度的逐渐增大，DNA的相对粘度随之增大。已有文献报道，如果小分子与DNA之间存在嵌插作用，DNA的相对粘度会增大[17]。粘度测定实验结果表明，席夫碱及3种配合物与DNA之间都存在嵌插作用。

图5 配合物加入前后的DNA粘度

Fig.5 DNA viscosity before and after the addition of the compounds

3.4 DNA熔点的测定

糠醛缩壳寡糖席夫碱及配合物对DNA的熔点产生了明显的影响，如图6所示，FCOS、FCOS-Cu11、FCOS-Cu13和FCOS-Cu31的加入，分别使DNA的熔点从70 ℃升高到75，74.5，72，75.5 ℃。药物小分子与DNA之间主要存在嵌插作用、沟槽作用和静电作用这3种方式。已有文献报道，如果药物小分子与DNA之间存在嵌插作用，药物小分子与DNA的碱基对之间能发生π-π堆积，使DNA双螺旋结构变得稳定，从而使DNA的熔点明显升高[18]。如果药物小分子与DNA之间仅仅是简单的沟槽作用、静电或氢键作用弱结合，DNA熔点的变化相对小很多。图6说明了席夫碱及配合物与DNA之间主要以嵌插作用结合。

图6 配合物对DNA熔点的影响

4 结 论

本文以糠醛和壳寡糖反应生成的席夫碱，与不同摩尔比的Cu2+配位得到具有电化学活性的配合物FCOS-Cu11、FCOS-Cu13和FCOS-Cu31，且配合物在玻碳电极上的反应主要由吸附过程控制。在DNA的作用下，配合物的氧化峰电流明显减小，峰电位发生位移。配合物的吸收峰峰位有红移趋势，吸收强度减色明显。配合物使DNA的相对比粘度和熔点增大。结果表明，席夫碱及配合物以嵌入方式和DNA作用。合成的席夫碱和铜配合物是一类潜在的抗肿瘤药物，其体外抑菌、抗肿瘤活性有待进一步研究。

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李小芳(1983-)，女，甘肃甘谷人，硕士，高级实验师，2009年于兰州大学获得硕士学位，主要从事功能高分子及有机稀土配位的研究。

E-mail: tslxffxq@163.com冯小强(1979-)，男，甘肃华亭人，硕士，副教授，2007年于兰州大学获得硕士学位，主要从事功能高分子的研究。

E-mail: fengxiaoqiang1979@163.com

DNABindingActivityofCopperComplexwithSchiffBaseDerivedfromOligochitosanandFurfuraldehyde

LI Xiao-fang, FENG Xiao-qiang*, ZHU Yuan-cheng

(SchoolofChemicalEngineeringandTechnology,TianshuiNormalUniversity,Tianshui741001,China)

*CorrespondingAuthor,E-mail:fengxiaoqiang1979@163.com

O611.4

A

10.3788/fgxb20173810.1359

1000-7032(2017)10-1359-07

2017-03-18；

2017-08-18

甘肃省青年科技基金计划(1606RJYE247)； 天水市科技支撑项目(2016年)； 甘肃省高等学校科学研究项目(2016B-071)； 天水师范学院中青年教师科研项目(TSA1508)资助 Supported by Youth Science and Technology Fund Program of Gansu Province(1606RJYE247); Science and Technology Support Project of Tianshui City(2016); Scientific Research Project Higher Education Institutions of Gansu Province (2016B-071); Research Project for Young and Middle-aged Teachers of Tianshui Normal University(TSA1508)