FTIR对酒炖熟地黄炮制终点的量化分析

樊克锋，赵建平，汤法银，孙素琴，周 群

(1.河南牧业经济学院，郑州 450046; 2.清华大学，北京100084)

FTIR对酒炖熟地黄炮制终点的量化分析

樊克锋1，赵建平1，汤法银1，孙素琴2，周 群2

(1.河南牧业经济学院，郑州 450046; 2.清华大学，北京100084)

利用红外光谱(FTIR)对酒炖熟地黄进行炮制过程和炮制终点评价分析。通过对熟地黄炮制过程中其整体红外特征吸收峰的变化趋势和变化规律来表征熟地炮制过程中其化学成分、生物形态(色味变化)及药学性质等的变化特点，最终利用熟地黄红外特征吸收峰(如1058、1026、817、797、777、1819、800及778 cm-1等)和相关峰面积比(A1/A2)等多因素指标来量化熟地黄“黑如漆，甜如饴”之传统炮制经验，制定酒炖熟地黄“炮制终点”红外标准，规范熟地炮制工艺，保证熟地质量品质。

FTIR;酒炖熟地黄;过程分析;相关峰面积比(A1/A2);炮制终点

Abstract: Evaluation and analysis on the processing and the processing end-point of wine stewed Rehmannia by FTIR. Through the whole process of characteristic IR absorption peaks of Radix Rehmanniae and Radix Rehmanniae changes in trends and changes in the law to characterize the processing of Radix Rehmanniae and its chemical composition and biological morphology (color taste change) change characteristic and pharmaceutical properties etc., Finally, useding multi factor index of infrared absorption characteristics(e.g.1058、1026、817、797、777、819、800 and 769 cm-1etc.) and correlation-peak-area ratio(A1/A2) of Radix Rehmanniae to quantify the traditional processing experience of "Black like paint, sweet as maltose" of Radix Rehmanniae, making infrared standard of wine stewed Rehmannia of “processing end-point”, specificating of processing technology of Radix Rehmanniae, ensuring the quality of Radix Rehmanniae.

Keywords: FTIR; wine stewed Rehmannia; process analysis; correlation-peak-area ratio(A1/A2); processing end-point

地黄系玄参科植物地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)干燥块根，始载《神农本草经》，为上品。生地，性凉味甘苦，功用清热凉血、养阴生津；熟地，性温味甘，功用滋阴补血、益精填髓，二者药性及功效不同。因此，生地炮制加工成熟地，其炮制质量对保证其药性及功效非常重要。传统熟地加工炮制“各地各法”甚多，《中国药典》收载两种：清蒸和酒炖。熟地传统经验标准(“黑如漆，甜如饴”)和《中国药典》规定(酒炖加工至酒吸尽，表面和断面呈乌黑，有光泽，味甜等)都没有客观确切的量化标准，难以满足熟地炮制工艺规范化和饮片质量标准化的要求和临床应用要求。研究利用红外光谱法宏观快速跟踪熟地整个炮制过程，通过分析红外谱图整体特征变化趋势和变化规律，来量化熟地加工最佳“炮制终点”。

红外光谱(FTIR)检测分析复杂混合体系的中药，其光谱特征具有化学信息整体综合性特点与优势，其指纹性如同单一组分一样，光谱中的峰位、峰形、峰强度代表着体系中所含相应各种基团的谱峰，它反映的是一个混合体系中各种成分的叠加谱，不同混合体系其相应的化学组成不同，会引起分子光谱整体谱图的变化，因此便构成谱图的宏观整体 “指纹”性。凭借这些宏观整体“指纹”特征，可以直接地或者借助数学处理进行中药的鉴定与质量评价。针对红外光谱分析中药复杂混合体系，清华大学孙素琴教授根据混合物红外光谱整体宏观特征建立了一系列针对性方法，即“多级红外光谱宏观指纹分析法”[1-2]，其分析原则是“从整体分析到特征分析，先定性分析再量化分析”。

1 材料与方法

1.1 材料 仪器设备：Spectrum GX型付里叶变换红外光谱仪(美国Perkin-Elmer)；生地黄：购于河南武陟县饮片厂(统货)，河南中医药大学生药学教研室鉴定；酒炖地黄炮制样品：由上述生地黄样品炮制加工而成，即参照《中国药典》及《河南中药材炮制规范》熟地黄项下要求：取生地黄适量，切片，50%量加黄酒，闷过夜，三角瓶口药棉塞紧，隔沸水炖60 h，每隔若干小时取样一次，低温干燥，粉碎(80目)，做供试样。黄酒：浙江绍兴双宫灯黄酒生产。

1.2 方法 测试条件：测定范围4000～400 cm-1，中红外DTGS检测器，OPD速度2 cm/s，扫描次数16次，分辨率4 cm-1，实时扣除H2O和CO2；测定方法：KBr压片法制样，取供试样及溴化钾(光谱纯)各适量充分混合研磨均匀，压片，按测试条件测定，得样品红外光谱图；二阶导数谱：利用仪器自带软件获取，即打开样品红外光谱(吸光度谱)，选[处理]→[导数]→[导数阶数-二阶]→[斜率计算数据点数量-13]即可；色谱方法和条件：参《中国药典》(一部)地黄项下梓醇含量高效液相法测定[3]，ODSC18色谱柱，流动相乙腈-水(0.6∶99.4)，流速1 mL/min，检测波长210 nm，柱温25 ℃。

2 结 果

2.1 地黄炮制过程颜色性状变化 《中国药典》描述熟地黄“表面和断面呈乌黑”。从样品粉末颜色性状来看，酒炖过程中颜色由生地棕黄色逐渐转变为乌黑色，5 h时样品粉末还略有棕黄色影痕，10 h时样品粉末完全呈乌黑色，如图1所示。那么，按照经验判断熟地“颜色变黑即变熟”是不严谨的。

2.2 酒炖熟地黄炮制过程红外光谱图特征分析[4-6]依据“复杂混合物多级红外光谱宏观指纹分析法”，首先根据地黄化学成分特点找到主成分特征吸收峰或特征波段，如图2所示，因地黄富含糖分,谱图变化重点在1200～900 cm-1波段和900～700 cm-1两个波段。前者主要就是糖的C-O(H)键弯曲振动吸收，后者主要是糖环的不同振动吸收。

图1 酒炖熟地炮制过程样品粉末颜色变化Fig 1 Color change of sample powder during processing of wine stewed Rehmannia

图2 生地黄和熟地黄原始红外光谱图Fig 2 Original infrared spectra of Rehmannia Glutinosa and Radix Rehmanniae Preparata

熟地黄炮制过程,主要就是糖的转化过程,所以这些特征波段红外光谱规律性变化表征了熟地黄炮制过程中所含糖的变化规律。如图3a所示，在1200～850 cm-1波段，主成分特征峰由1050 cm-1单强峰逐渐变为1058和1026 cm-1双强峰。如图3b，在900～700 cm-1波段，831、797和771 cm-1三个“山形峰”逐渐变成817、797和777 cm-1三个“阶梯峰”，尤其是777cm-1特征峰变化突出。为提高光谱图分辨率，增强特征信息，取“山形峰”的二阶导数谱分析, 如图3c，10 h时832 cm-1峰逐渐先变成834和817 cm-1峰，770 cm-1峰逐渐先变成778和769 cm-1峰，800 cm-1峰基本不变。15 h后图谱趋于稳定为819、800和769 cm-1峰三个特征峰。总的从以上整体谱图峰位、峰型和峰强变化来看，整个过程变化特征突出规律明显，即以800 cm-1为中心，832和770 cm-1逐渐减弱并高波段，10 h的谱图出现817和778 cm-1特征峰并逐渐增强，15 h后吸收强度相当的819、800和778 cm-1三特征峰突出。图谱表明酒炖熟地5 h后才开始有明显的化学变化；10 h时谱图最复杂，说明此炮制阶段正发生复杂的化学成分变化；15 h后谱峰特征性明显稳定化。

2.3 酒炖熟地炮制过程中的理化分析及777 cm-1特征吸收峰光谱分析 地黄富含低聚糖类，其中以水苏糖为主。生地经炮制加工成熟地,主要就是低聚糖转化成单糖。若含量为主的水苏糖在酒炖过程中完全转化，那么将得到2分子半乳糖、1分子葡萄糖和1分子果糖。水解所得单糖可使得熟地黄“甜如饴”；水解所得的果糖能与氨基酸反应成蛋白黑素，故认为是由水苏糖水解得到的大部分果糖与地黄所含氨基酸反应生成了蛋白黑素，一方面使得熟地黄“黑如漆”，同时使得果糖的含量减少到与分解所得的葡萄糖含量之比接近 1∶5，出现了777 cm-1的特征峰。如图4所示，通过图谱加减谱模拟和实验验证，表明如果按照葡萄糖∶果糖≈5∶1的配比进行混合，恰好可以得到777 cm-1处的特征峰。

图3 酒炖熟地炮制过程特征波段红外光谱(a和b)及二阶导数谱(c)Fig 3 Characteristic band infrared spectrum(a and b) and second derivative spectrum(c) of processing of wine stewed Rehmannia

图4 葡萄糖(a)、果糖(b)和葡萄糖与果糖(5∶1)叠加(c)红外光谱Fig 4 Glucose (a),fructose (b),glucose and fructose (5∶1) (c) infrared spectra

2.4 红外光谱结合熟地黄炮制过程中化学成分、生物形态及药学性质等相关性分析 生地炮制成熟地过程主要就是糖转化过程。在这个过程中，不论是地黄生物形态(色味)、药学性质(性味功效)变化，还是红外光谱特征变化都与主成分变化有关如，表1所示。因而可以利用红外光谱的特征信息来表征熟地黄炮制过程化学成分、生物形态及药学性质等的相关变化和变化特点。具体说就是：当主强峰由单强峰变为双强峰、特征波段山形峰变成阶梯峰、特征峰777 cm-1明显及二阶导数819、800和778 cm-1三谱峰突出时，才基本可以判断熟地黄的炮制火候已到，传统性状“黑如漆、甜如饴”的生态学特点确切，糖转化完全，指标成分梓醇含量逐渐减少在15 h时出现明显拐点且其后逐渐检测不到[7]，此时熟地临床“味甘性温效滋补”的药学性质可靠。

表1 酒炖熟地炮制过程中红外光谱与化学成分、生物形态及药学性质等变化的相关性分析Tab 1 Correlation analysis of infrared spectrum and chemical composition, biological morphologyand pharmaceutical properties of processing of wine stewed Rehmannia

2.5 利用相关峰面积比量化酒炖熟地“炮制终点”[8]酒炖熟地炮制过程中，因发生糖转化则主成分及其他相关吸收峰的峰面积也都发生相应的规律性变化。为了避免样品用量、光程长度等因素导致的单一特征光谱强度差异的影响，需要选择相关吸收峰做为参比峰，其二者确定的相关峰值比(峰面积比A1/A2或比峰高H1/H2)是可信的量化指标。如图5所示，对各样品红外光谱分别基线校正及归一化处理，即：基线校正后以O点为最低基点进行归一化处理，其水平基线分别与样品红外光谱交与P、R两点，另选主成分峰光谱特征点引竖直垂线交于水平基线于Q点，分别选定QR波段和OP波段做为主成分峰-1和参比峰-2，若设其峰面积分别为A1和A2，则A1/A2表示为“相关峰值比”。用“相关峰值比(A1/A2)”来量化表征熟地黄炮制过程中“主成分峰”的变化趋势和变化程度，则得到如表2量化值。

表2所示，在酒炖地黄60 h内，单独A1和A2值的大小受样品量、光程差等因素影响，但是其二者相关峰面积比值(A1/A2)大小是由样品性质决定，且不受样品量、光程差等因素影响。

图6所示，酒炖地黄60 h过程中，0～15 h内相关峰面积比值(A1/A2)持续快速减小，且约有2个单位的差值(5.49-3.65=1.85)，15 h处出现拐点，之后A1/A2值减小速率明显降低，再之后基本稳定。

图5 地黄红外光谱主成分峰-1和参比峰-2归一化处理图谱Fig 5 Principal component peak-1 and reference peak-2 normalized processing infrared spectrogram of Rehmannia

表2 酒炖熟地炮制过程主成分峰面积(A1)、参比峰面积(A2)及二者比值(A1/A2)变化规律Tab 2 Change regulation of Principal component peak area (A1), reference peak area (A2) and the ratio of two (A1/A2) of processing of wine stewed Rehmannia

图6 酒炖熟地炮制过程相关峰面积比(A1/A2)变化趋势Fig 6 Changing tendency of Correlation-peak-area ratio(A1/A2)of processing of wine stewed Rehmannia

表3 酒炖熟地炮制过程红外特征化指标综合分析Tab 3 Comprehensive analysis of infrared characteristic index of processing of wine stewed Rehmannia

综合上述于表3所示，在酒炖熟地炮制变化过程中，10 h左右是各项指标特征开始出现或复杂变化态，15 h时各项指标都趋于稳定特征化：(1)性状变化：即颜色完全变黑；(2)谱图特征：双强峰(1057-1026)、阶梯组峰(817-797-777)、777特征峰及二阶导数谱峰(819-800-778)等特征化稳定；(3)量化指标： A1/A2值持续降低，在15 h时拐点明显且趋于稳定， A1/A2≈3.5，和生地黄相比A1/A2差值降低约2个单位。

3 讨 论

熟地黄加工方式和炮制程度都极大地影响着其质量品质，常因加工火候“过或不及”多有“酸败”或“生制”现象，导致临床用药效果偏差或错失。鉴于单指标成分(梓醇)无法客观评价熟地黄的整体质量品质，利用红外光谱技术“从整体到特征、先定性再定量”，对熟地炮制过程中其生物形态、化学成分及药学特点等进行整体性相关分析，得到“客观整体”的量化质量标准，进而有效监控熟地黄炮制加工程度，提高了熟地黄质量品质。相比其他分析方法，利用红外光谱“相关峰面积比(A1/A2)”来评价酒炖熟地炮制程度具有“整体性和量化性”特点，其指标意义更客观可靠，方法手段更方便快捷。

研究表明，酒炖熟地“炮制终点”应在15 h左右，此时上述各项红外指标因素特征化明显且稳定。但基于实际加工生产的条件和技术不同(如给热方式、气压、温度、大小分档或是否切片等)，那么时间仅是变量因素，做为红外光谱技术整体分析来说，熟地黄炮制程度必须达到：(1)光谱表征：双强峰(1057-1026)、阶梯组峰(817-797-777)、777特征峰及(819-800-778)二阶导数谱等特征化明显且稳定；(2)量化指标：A1/A2值降低拐点化，或确认A1/A2≈3.5为熟地黄炮制终点量化值。这样才能避免熟地炮制“不及则功效难求，太过则气味反失”，才能避免“颜色变黑即变熟”的经验误判。

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(编辑：陈希)

QuantitativeAnalysisontheProcessingEnd-pointofWineStewedRehmanniaByFTIR

FAN Ke-feng1, TANG Fa-yin1,ZHAO Jian-ping, SUN Su-qin2,ZHOU Qun2

(1.HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou450000,China; 2.TsinghuaUniversity,Beijing100084,China)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.9.09

2017-03-18

A

1002-1280 (2017) 09-0049-07

S853.7

河南省青年骨干教师项目基金(2013GGJS-191)

樊克锋，硕士，清华大学化学系访问学者，从事现代分析技术对中药质量品质方面研究。E-mail: fanke333@aliyun.com