急性应激后小鼠空间学习记忆及脑内HIF—1α表达的变化

高晓晓+张雅普+李亚

【摘 要】目的 研究急性应激强度下小鼠学习记忆能力的变化以及海马和前脑皮层HIF-1α的表达。方法 采用电击足底方式对小鼠急性应激处理，通过Morris水迷宫实验检测小鼠的空间学习记忆能力，采用免疫组织化学方法检测小鼠海马和前脑皮层缺氧诱导因子（HIF-1α）的表达。结果 急性应激组小鼠在水迷宫实验中的空间学习记忆能力比正常对照组小鼠明显增强（P<0.05）；脑内海马CA1区、CA3区、齿状回和前脑皮层HIF-1α的表达显著增加（P<0.01）。结论 急性应激后，HIF-1α在海马和前脑皮层表达增加，可能参与应激引起小鼠学习记忆功能的增强。

【关键词】急性应激；空间学习记忆；HIF-1α； 海马；前脑皮层

【Abstract】Objective To study the changes of spatial learning-memory ability after acute stress， and the expression of Hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α） of prefrontal cortex （PFC） and hippocampus （HP） in mice brain. Methods The acute stress model mice with foot shock were applied. The spatial learning- memory in mice was determined by Morris water maze task， and the expression of HIF-1α in HP and PFC were observed by immunohistochemical method. Results Compared with the control group mice， the ability of spatial learning and memory in acute stress group mice were significantly increased （P<0.05）. The expression of HIF-1α in CA1， CA3 and dentate gyrus of HP and PFC were significantly enhanced in acute stress group mice （P<0.01）. Conclusion The enhancement of learning-memory function induced by acute stress in mice， which may be nearly associated with the up-regulated of HIF-1α expression in HP and PFC.

【Key words】acute stress； spatial learning and memory； HIF-1α； hippocampus； PFC

机体处于一定的社会环境中，总有类似的包括压力、刺激、惊吓、紧张等刺激使机体产生应激反应，由于这些刺激的强度、来源以及时间和频率出现的不可预见性，将对人类的身心健康产生不同程度的影响。研究表明，适宜强度的应激对于机体而言是有利的[1]，将有利于提高机体对外界刺激的警觉能力，使机体反应更加敏锐，提高对周围环境的适应能力，有助于机体提高自身技能，包括对外界环境的探索能力以及部分脑区的高级活动，如学习记忆功能的改善。

研究表明，在接受外界不同程度的刺激过程中，体内激素水平及相关蛋白表达会发生相应的而变化。缺氧诱导因子（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α），是一种转录激活因子[2]，介导多种细胞和系统缺氧时的稳态维持；研究表明，HIF-1α的下游靶基因如促红细胞生成素（EPO）以及血管内皮生长因子（VEGF）等皆为保护样神经因子[3]。本研究采用急性应激处理小鼠，检测小鼠在水迷宫中的空间学习记忆能力以及前脑皮层和海马HIF-1α的表达，探讨在一定的应激强度下，小鼠学习记忆的改变与HIF-1α的联系。

1 材料与方法

1.1 动物分组及应激方法

昆明品系小白鼠，3月龄，体重18～20g；雌雄各半。济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK（鲁）20140007。购买后的小鼠于实验室环境下适应一周，提供充足的食物和水。急性应激方法采用电击足底，强度36v，30s/次，间隔15s刺激一次，共30次。对急性应激组小鼠实施足底电击，正常对照组小鼠不接受实验应激源，正常饲养。

1.2 Morris水迷宫检测小鼠的空间学习记忆能力

采用Morris水迷宫检测各组小鼠的空间学习记忆能力。水迷宫由一圆形水池和一可移动隐匿的平台组成，水池直径80 cm，高50 cm，分为四个象限，平台置于第一象限（目标象限）。测试过程分两部分：第一部分，定位航行实验。实验中将小鼠头部用苦味酸染色，以使得实验系统可以跟踪到小鼠。小鼠从四个象限入水，记录不同组小鼠从不同位置入水至爬上平台所需要的时间，求得各组小鼠的逃避潜伏期（ escape latency），逃避潛伏期越短，小鼠空间学习能力越强。第二部分，空间搜索实验。将平台撤掉，将小鼠从第三象限入水，记录小鼠在原平台象限的停留时间。小鼠在原平台象限停留时间越长，小鼠的空间记忆能力越强。

1.3 小鼠脑内海马区和前脑区HIF-1α的表达

在水迷宫实验结束后，用戊巴比妥钠麻醉小鼠，采用灌流取脑技术将小鼠的脑组织取出，经多聚甲醛溶液中后固定2小时，PBS冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋等过程，切片后采用免疫组织化学技术检测小鼠相关脑区HIF-1α的表达情况。免疫组化过程均按照试剂盒（武汉博士德生物公司）说明进行。最后选取每只小鼠海马CA1区、CA3区、齿状回（DG）以及前脑皮层（PFC）切片3张，每张图片随机选取2个相应部位。采用Motic Images Advanced3.2图像处理系统计算HIF-1α阳性神经元平均目标灰度值。endprint

1.4 统计学处理

数据采取平均数±标准误（M±SE）的方式来表示。其中，Morris水迷宫逃避潜伏期数据处理采用重复测量方差分析（repeated-measures ANOVA）；各象限游泳时间采用单因素方差分析（one-way ANOVA），各组间数据的比较采用Newman-Keuls法进行分析；其他数据的组间比较采用非配对t检验， 以P <0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠Morris水迷宫空间学习记忆能力检测

定位航行实验数据经过统计学分析显示（表1），正常对照组和急性应激组小鼠的逃避潜伏期均迅速下降（F=6.378，P<0.01；F=8.546，P<0.01）。与正常对照组比较，急性应激组小鼠的逃避潜伏期在第二、三和四训练周期，均明显缩短，有显著性差异（P<0.05）。结果表明，急性应激可增强小鼠的空间学习能力。

空间搜索实验中小鼠在各象限停留时间结果显示（表2），正常对照组和急性应激组小鼠在第一象限（目标象限）停留的时间比其他三个象限的停留时间均显著增长（F=5.783，P<0.05；F=9.675，P<0.01）；与正常对照组相比，急性应激组小鼠在目标象限停留时间显著增长（P <0.05）；而在目标象限的相对象限（第三象限）停留時间明显缩短（P<0.01）。结果表明，急性应激可增强小鼠对原平台记忆的保持能力。

2.2 各组小鼠海马和前脑皮层HIF-1α的表达情况

各组小鼠HIF-1α表达的免疫组织化学染色显示，在海马和前脑皮层都有广泛表达。统计结果显示，与正常对照组比较（表3），急性应激组小鼠前脑皮层（PFC）和海马CA1、DG区HIF-1α阳性神经元平均目标灰度值显著减少（P<0.01，P<0.05，P<0.01），在CA3区差异不显著。结果表明，急性应激后小鼠海马和前脑皮层HIF-1α的表达增强。

3 讨论

相关研究显示，适当的应激会提高小鼠的学习记忆能力，而过强的应激则会使小鼠和人的学习记忆能力低下[4]。研究表明，应激会导致机体垂体-肾上腺皮质及交感-肾上腺髓质功能增强，明显影响机体的学习和记忆能力[5]。也有研究显示，慢性应激导致动物学习记忆能力低下，空间学习记忆受损；这可能与应激强度以及时长相关。我们实验室先前的研究表明，急性应激明显增强小鼠的空间学习记忆能力，这种效应可能与海马和前脑皮层GDNF的表达密切关系[6]。本实验结果表明，急性应激后小鼠在Morris水迷宫中的逃避潜伏期显著缩短，目标象限停留时间明显延长，说明急性应激后小鼠的空间学习记忆能力显著增强。

HIF-1在哺乳动物中广泛表达，对氧气的稳态调节起重要作用，是具有转录活性的核蛋白。受缺氧调控的 HIF-1α 是活性亚基，HIF-1α在常氧时合成和降解同时发生，经脯氨酸羟化（Prolylhydroxylase，PHD）羟化修饰后降解，维持在低水平。有研究报道，在使用了HIF-1α的抑制剂PHD后，小鼠海马记忆能力明显提高；而痴呆模型大鼠的HIF、EPO表达与学习记忆能力呈高度正相关[7]。研究表明，HIF-1α可通过 MAPK信号通路和PI3K/Akt信号通路表达调控其下游因子[8]。相关研究显示，EPO mRNA的表达是以HIF的表达为基础的，高剂量EPO有助于改善动物的学习记忆[9]，而在敲除HIF-1α基因后，VEGF等因子并不能被正常激活。本研究结果表明，急性应激后，小鼠海马各区和前脑皮层HIF-1α阳性神经元平均灰度值明显降低，海马和前脑皮层HIF-1α的表达显著增强。因此，可以推测，机体可能通过提高HIF-1α表达来激活其靶基因的表达如EPO以及VEGF等保护因子，来实现对学习记忆能力的调节。

【参考文献】

[1]Lupien SJ， McEwen BS， Gunnar MR， et al. Effects of stress throughout the lifespan on the brain， behaviour and cognition[J]. Nat Rev Neurosci， 2009， 10（6）： 434-445.

[2]Majmundar AJ， Wong WJ， Simon MC. Hypoxia inducible factors and the response to hypoxic stress[J]. Mol Cell， 2010， 40（2）： 294-309.

[3]汤盈，等.缺氧诱导因子-1（HIF-1）对促红细胞生成素（EPO）等靶基因表达的影响[J].四川体育科学，2006，（3）：26-29.

[4]嵇志红，高伟.应激对动物行为和学习记忆能力的影响[J].大连大学学报，2002，（4）： 81-84.

[5]McEwen BS. Protective and damaging effects of stress mediators： central role of the brain [J].Dialogues Clin Neurosci，2006，8（4）：367-381.

[6]陈亚静，史建勋，张冠雄，等.急性应激对小鼠空间学习记忆功能及脑内GDNF表达的影响[J].科技信息.2012，9：24-25.

[7]张蓓，吴海琴，等.低氧诱导因子-1、促红细胞生成素在血管性痴呆大鼠海马的表达[J].四川大学学报（医学版），2006，（5）：730-733.

[8]Cavadas MA， Nguyen LK， Cheong A. Hypoxia-inducible factor （HIF） network： insights from mathematical models [J]. Cell Commun Signal， 2013， 11：42.

[9]Adamcio B， Sperling S， Hagemeyer N， et al. Hypoxia inducible factor stabilization leads to lasting improvement of hippocampal memory in healthy mice [J].Behav Brain Research，2010，208（1）：80-84.

[责任编辑：张涛]endprint