高效液相色谱-柱后衍生法测定保健品中维生素B1的含量*

何孟杭，潘丹婷，梁敏，黄何何，戴明

（1. 福建省产品质量检验研究院 国家加工食品质量监督检验中心，福建 福州 350002；2. 中国人民解放军第180医院，福建 泉州 362000）

高效液相色谱-柱后衍生法测定保健品中维生素B1的含量*

何孟杭1，潘丹婷2，梁敏1，黄何何1，戴明1

（1. 福建省产品质量检验研究院 国家加工食品质量监督检验中心，福建 福州 350002；2. 中国人民解放军第180医院，福建 泉州 362000）

文章建立了测定保健品中维生素B1含量的高效液相色谱-柱后衍生法。方法采用色谱柱：UltimateXB-C18（4.6mm×150mm，5μm）；流动相：（0.01%辛烷磺酸钠+1.5 %乙酸+5%甲醇+0.12%三乙胺）-甲醇（65∶35）；流速：1.0 mL /min；柱温：35℃；检测波长：Ex= 375nm，Em= 435nm。研究发现该柱后衍生法测定同一样品中维生素B1含量得到的峰面积是柱前衍生法测定结果的1.6-18.8倍，维生素B1含量在0.01-32μg/mL范围内线性良好，R2=0.999，检出限为1 ng/mL。该方法灵敏、简便、准确，重现性好，可用于保健品中维生素B1含量的测定。

维生素B1；高效液相色谱；柱后衍生法

维生素B1，又称硫胺素或抗神经炎素，在体内以辅酶形式参与糖的分解代谢，有保护神经系统的作用；还能促进肠胃蠕动，增加食欲，是一种常见的辅助药物[1]。如果人体长期缺乏维生素B1会引起糖代谢障碍和多发性神经炎及脚气病[2]。在中华人民共和国国家标准的相关规定中，维生素B1的检测方法主要有紫外-可见分光光度法[3]、荧光分光光度法[4-6]、化学分析法[7-9]、高效液相色谱法[4,10]等。目前，维生素B1的检测多采用柱前衍生-液相色谱-荧光检测法。但由于柱前衍生法存在一些缺点：1.形成的副产物可能对色谱分离造成较大困难；2.在衍生化过程中，容易引入杂质或干扰峰，或使样品损失；3.检测样品中很可能含有维生素C等还原性的物质，该类物质可与铁氰化钾发生氧化还原反应，从而干扰硫色素反应，使衍生反应不完全，进而影响维生素B1的定量。因此，文章采用将维生素B1在柱后衍生为荧光产物，避免了样品中还原性物质（如维生素C）与衍生剂中的铁氰化钾发生氧化还原反应，运用高效液相色谱-柱后衍生-荧光检测法对维生素B1进行定性、定量，同时与高效液相色谱-柱前衍生法的测定结果进行比较。

1 c仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱仪；Waters 2475荧光检测器；Waters柱后反应器；电热手提高压蒸汽消毒器（上海医用核子仪器厂）；台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；pH试纸（杭州特种纸业有限公司）；维生素B1对照品（上海安普科学仪器有限公司）；甲醇、辛烷磺酸钠为色谱纯；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品柱前衍生分析

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Ultimate XB-C18（4.6mm×150mm，5μm）；流动相：0.05 mol/L醋酸钠（pH=4.5）的磷酸盐溶液；流速：1.0mL/min；柱温：35℃，检测波长：Ex= 375nm，Em=435nm；进样量：10μL。

2.1.2 样品提取

称取一定量样品于锥形瓶中，加45ml蒸馏水溶解，再加入5ml浓度为 2mol/L的HCl溶液，锡箔纸封口，置于电热手提高压蒸汽消毒器中，在125℃条件下消解30 min后取出，迅速冷却；用15%的KOH溶液调节pH至5，转移至100ml容量瓶中，定容，过滤。

2.1.3 提取液柱前衍生化

取上述滤液1.00mL于10mL具塞比色管中，加入1mL碱性铁氰化钾溶液，充分混匀后，加5.00mL正丁醇，强烈振荡后静置约10min，充分分层，吸取正丁醇相（上层）于4000～6000r/min离心5min，取上清液经有机微孔滤膜（0.45μm）过滤，供进样用。另取1.00mL，浓度为4.12μg/mL的维生素B1对照品溶液，与试液同步进行衍生化。

2.2 样品柱后衍生分析

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Ultimate XB-C18（4.6mm×150mm，5μm）；流动相：（0.01 %辛烷磺酸钠+1.5 %乙酸+5%甲醇+0.12 %三乙胺）-甲醇（65∶35）；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；以碱性铁氰化钾溶液作衍生剂，流速：0.45mL/min；进样量：10μL；检测波长：Ex=375nm，Em= 435nm；进样量：10μL。

2.2.2 供试品提取

供试品提取步骤同2.1.2处理后，再取滤液经有机微孔滤膜（0.45μm）过滤，供进样用。

2.3 方法的线性范围及检出限实验

在优化后的实验条件下对不同浓度的维生素B1标准溶液进行分析，以维生素B1的浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线（图1），由实验得出维生素B1在0.01～32μg/mL浓度范围内呈线性关系，回归方程为：Y=1.175×108X-8.09×106，R2=0.999。以3倍信噪比（S/N）计算方法检出限为1 ng/mL。

图1 维生素B1标准溶液浓度与峰面积的关系图

2.4 加标回收率实验

回收率实验以不含维生素B1的某品牌保健品为空白基质，进行0.05、0.5、5μg /g 3个浓度水平的添加回收试验，每个浓度水平重复5次，得到维生素B1的回收率和精密度列于表1。

表1 加标回收率实验结果（n=5）

2.5 柱前衍生法和柱后衍生法测定样品中维生素B1含量的结果比较

2.5.1 对照品溶液的测定结果比较

实验中我们考察了柱前衍生-HPLC和柱后衍生-HPLC对同一维生素B1标准溶液的测定情况，图2为这2种方法测定维生素B1的色谱图，从实验结果可知，柱前衍生法（图2(1)）中维生素B1的保留时间短，峰面积为9664842，柱后衍生法（图2(2)）中维生素B1的保留时间长，且峰面积为90353315。

图2 柱前衍生-HPLC（1）与柱后衍生-HPLC（2）测定维生素B1标准溶液的色谱

2.5.2 供试品溶液的测定结果比较

实验还考察了3种供试品采用柱前衍生-HPLC和柱后衍生-HPLC对维生素B1含量的测定，2种方法测定每种供试品的实验数据见表2和表3。数据结果可以得出，柱后衍生法测定同一供试品中维生素B1得到的峰面积是柱前衍生法测定结果的1.6-18.8倍，说明柱后衍生法降低了柱前衍生存在的负影响，提高了检测方法的灵敏度，该方法用于保健品中维生素B1含量的测定是可行的。

表2： 柱前衍生法测定3种供试品溶液实验数据

表3：柱后衍生法测定3种供试品溶液实验数据

3 讨论

3.1 提取条件的优化

由于维生素B1为白色结晶体，易溶于水，在酸性溶液中很稳定，在碱性溶液中不稳定，易被氧化，受热易被破坏，所以溶剂均以HCl为调节剂[1]。维生素B1在pH=2的HCl溶液中以分子状态存在，稳定性良好，但pH＞5时，将会分解[11]。因此，样品经酸水解后，选择用15%的KOH溶液调节pH至5，以确保试验在酸性环境中进行，便于结果的准确性。

3.2 分离模式的优化

维生素B1是由氨基嘧啶环和噻唑环通过亚甲基连接而成的季铵类化合物，噻唑环上的季铵及嘧啶环上的氨基为两个碱性基团，可与酸成盐。考虑到维生素B1在一定条件下可以以离子形式存在，因此采用离子对模式进行分离。而离子对色谱法中，分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如辛烷磺酸钠可与碱性样品形成很强的离子对。同时，离子对色谱法常采用C18柱，在一定的pH范围内进行分离。因此，文章以辛烷磺酸钠为离子对试剂，用C18柱以反向离子对模式进行分离。

3.3 流动相的优化

方法在文献[12]的基础上，选择了辛烷磺酸钠作为离子对试剂来分离测定水溶性维生素。实际操作中发现，流动相中不加三乙胺，维生素B1的峰形严重拖尾；加入三乙胺后，各峰的峰形和分离度均显著改善，保留时间也大大减少。通过反复试验，优化出最佳流动相条件为（0.01%辛烷磺酸钠+1.5%乙酸+5%甲醇+0.12%三乙胺）-甲醇（65∶35）。采用该流动相，分离效果好，且容量因子适中，结果满意。

4 结论

结果表明，方法较好地解决了样品维生素B1的提取、净化与杂质分离等问题。该方法具有专属性强、线性范围广、灵敏度高、样品处理简便的优点，同时还可避免还原性物质等对化学衍生反应的干扰，是保健品中维生素B1含量测定较理想的方法。

[1] 杨晓玲，李爱民，李绍贤.HPLC法测定维生素B1的含量[J].安徽医药,2006(12)：928-92.

[2] 田林芹，张爱梅.动力学光度法测定维生素B1的研究[J].理化检验,2005,41(4)：255-258.

[3] 国家药典委员会,中华人民共和国药典(二部)[M].北京：化学工业出版社,2010：896-897.

[4] 全国饲料工业标准化技术委员会.饲料中维生素B1的测定：GB/T 14700-2002[S].北京：中国标准出版社，2003：3.

[5] 中华人民共和国卫生部.食品中硫胺素（维生素B1）的测定：GB/T 5009.84-2003[S].北京：中国标准出版社，2004：1.

[6] 全国粮油标准化技术委员会.谷物中维生素B1测定：GB/T 7628-2008[S]. 北京：中国标准出版社，2008：10.

[7] 全国饲料工业标准化技术委员会.饲料添加剂 维生素B1（盐酸硫胺）：GB/T 7295-2008[S].北京：中国标准出版社，2008：5.

[8] 全国饲料工业标准化技术委员会.饲料添加剂 维生素B1（硝酸硫胺）：GB/T 7296-2008[S].北京：中国标准出版社，2008：6.

[9] 中华人民共和国卫生部.食品添加剂 维生素B1（盐酸硫胺）：GB 14751-2010[S].北京：中国标准出版社，2011：2.

[10] 全国肉禽蛋制品标准化技术委员会.肉与肉制品维生素B1含量测定：GB/T 9695.27-2008[S].北京：中国标准出版社，2008：11.

[11] 杨政,蒋俊春,孙硕远.差示分光光度法测定维生素B1片的含量[J].医药论坛杂志,2006,27(15)：108.

[12] 卢慧卿.高效液相色谱-荧光检测法测定复合维B片中维生素B1含量[J].中国药业,2008,17(15)：24-25.

10.3969/j.issn.1007-550X.2017.03.002

O657.7+2

A

1007-550X（2017）03-0036-04

福建省质量技术监督局科技项目（FJQI2014037）

2017-01-10

何孟杭（1985- ），男，福建宁德人，工程师，硕士研究生，主要从事食品加工技术研究。