氯化钾溶液刺激星形胶质母细胞瘤细胞对MKK4的影响

郝凌云 杨小雪 王沁玥 孙梦兰 潘志强

徐州医科大学江苏省麻醉学重点实验室D405，江苏 徐州 221002

·论著科研之窗·

氯化钾溶液刺激星形胶质母细胞瘤细胞对MKK4的影响

郝凌云 杨小雪 王沁玥 孙梦兰 潘志强△

徐州医科大学江苏省麻醉学重点实验室D405，江苏 徐州 221002

目的观察不同浓度氯化钾(KCl) 溶液刺激人脑星形胶质母细胞瘤细胞(U87)后MKK4及其下游蛋白p38 MAPK的表达，初步探讨MKK4以及 p38 MAPK在核酸水平的表达变化特点。方法U87细胞采用不同浓度KCl刺激，采用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)方法检测MKK4及 p38 MAPK mRNA表达的变化。将细胞分为对照组(0组)、不同浓度KCl组(0.001 mmol/mL，0.025 mmol/mL，0.05 mmol/mL，0.1 mmol/mL，分别标记为0.001、0.025、0.05、0.1组)。结果RT-PCR结果显示：经KCl刺激后，各组星形胶质细胞均有MKK4以及 p38 MAPK mRNA 的表达，其表达量均为先上升后下降，在0.05组达到高峰，此后回落。结论KCl刺激可使人脑星形胶质母细胞瘤细胞中MKK4以及 p38 MAPK mRNA 的表达增高，其表达与KCl浓度有关。

氯化钾；星形胶质细胞；MKK4；p38 MAPK

丝裂原活化蛋白激酶激酶4(mitogen-activated protein kinasekinase4，MKK4)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)信号转导通路中的组成部分，属MAPKK家族的一个成员。Yoshida 等[1]利用微细胞染色体转移和定点克隆方法分离出MKK4 基因，位于人类第17 号染色体。MKK4 蛋白结构由3 个部分组成：位于N 端的D 域序列在级联反应中与c-Jun 氨基端激酶和p38 MAPK连接；位于C 端的DVD 域序列与上游的各种MKKKs 级联；中间部分为激酶区[2]。 MKK4是一种有双重特异性的激酶，能同时磷酸化并激活JNK 通路与P38 MAPK通路[3-4]。

1 材料与方法

1．1主要试剂人脑星形胶质母细胞瘤细胞(U87)由本实验邢艳红老师赠与，DMEM(Hyclone)，胎牛血清(FBS)购自福麦斯生物科技有限公司，RT-PCR试剂均购自Takara公司。

1．2细胞培养及实验分组培养星形胶质细胞于DMEM完全培养基中(含10% FBS)。将细胞接种于24孔板，待细胞长满皿底80%左右给予药物干预。分别给予不同浓度KCl刺激细胞，KCl终浓度分别为0.001、0.025、0.05、0.1(mmol/mL)，分别标记为：0.01、0.025、0.05、0.1 组，对照组(0组)，每孔加入500 μL新鲜DMEM完全培养基。药物干预时间均为24 h。

1．3 RT-PCR检测(1)总RNA提取和反转录：用Trizol法抽提得到总RNA，用随机引物oligodT进行逆转录反应得到cDNA。反应条件：37 ℃，30 min，42 ℃，30 min。将cDNA冻存于-20 ℃。(2)引物设计：所有引物均购自上海生工生物工程股份有限公司。MKK4的上游引物：5'-CCCTGAACAACACTGGGATT-3'，下游引物：5'-CTGCCATTA-TTTGCCCACTT-3'。P38 MAPK的上游引物：5'-TCGGCACACAGATGATGAA-3'，下游引物：5'-TGCATCCCACTGACCAAATA-3'。内参照GAPDH的上游引物：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物：5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。 (3) RT-PCR 扩增反应：逆转录产物cDNA 模板1 μL，待扩增的各基因上下游引物各0.5 μL，即用PCR 反应试剂盒反应溶液5.5 μL，ddH2O 2.5 μL，总体积10 μL。反应程序为：95 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，45 次循环，72 ℃延伸10 min。mRNA相对含量分析使用2-△△CT法[5]。

2 结果

2．1 KCl诱导星形胶质细胞MKK4 mRNA的表达RT-PCR 结果显示，经KCl刺激后，各组不同KCl浓度星形胶质细胞中均有MKK4 mRNA 的表达，结合方差分析，采用GraphPad Prism v 5.00统计软件制图可以看出，KCl各种浓度刺激诱导后MKK4 mRNA 表达均有不同程度的增高，在0.05组达到高峰，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

表1 RT-PCR检测MKK4 mRNA表达变化

注：各组分别与0组进行比较，*P<0.05

图1 不同浓度的KCl对MKK4 mRNA表达的影响 与0组比较，*P<0.05

2.2 KCl诱导星形胶质细胞p38 MAPK mRNA的表达RT-PCR结果显示经KCl刺激后，各组不同KCl浓度星形胶质细胞中均有p38 MAPK mRNA 的表达，结合方差分析，采用GraphPad Prism v5.00统计软件制图可以看出，KCl各种浓度刺激诱导后p38 MAPK mRNA 表达均有不同程度的增高，在0.05组表达达到高峰，差异有统计学意义(P<0.01)。表2、图2。

表2 RT-PCR检测p38 MAPK mRNA表达变化

注：各组分别与0组进行比较，**P<0.01

图2 不同浓度的KCl对p38 MAPK mRNA表达的影响 与0组比较，**P<0.01

3 讨论

MAPK家族是非常保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是信号转导过程中一组主要的信号分子，在发育和疾病发生过程中起重要作用。MAPK信号通路由三级激酶链组成：细胞受到刺激后通过某种中间环节使MAPKKK激活，转而激活MAPKK；MAPKK 激活后再通过双位点磷酸化调控MAPK的活性。 p38 MAPK是MAPK家族的成员之一，参与细胞内信号的传递，主要调控细胞内的炎症反应过程以及氧化应激反应过程[6]。紫外线照射、促炎细胞因子、应激刺激、脂多糖、外界物理化学因素的刺激以及缺血再灌注过程均会显著激活p38 MAPK 信号通路[7-9]。p38 MAPK信号通路的上游激活物是MKK3、MKK4及MKK6，其中MKK3、MKK6仅特异性激活p38 MAPK，MKK4能同时磷酸化并激活2 条MAPK 信号传导通路，即JNK 通路和p38 MAPK通路。本研究选取了MKK4-p38 MAPK信号传导通路。在给予人脑星形胶质母细胞瘤细胞不同浓度的KCl刺激后，我们首先检测了MKK4 mRNA的表达变化，发现不同浓度的KCl均能引起MKK4 mRNA不同程度升高，在0.05 mmol/mL达到高峰，此后下降。检测MKK4下游蛋白p38 MAPK mRNA的表达变化发现，p38 MAPK mRNA和MKK4 mRNA的表达变化呈现相同的趋势，即不同浓度的KCl亦均能引起p38 MAPK mRNA不同程度的增高，在0.05 mmol/mL达到高峰，此后下降。但p38 MAPK mRNA升高的程度(P<0.01)要高于MKK4 mRNA升高的程度(P<0.05)，在此信号通路之外是否有其他的上游蛋白比如MKK3/MKK6也被激活从而又激活p38 MAPK，这些信号通路之间有无相互作用，是我们接下来要研究的内容。

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(收稿2017-05-27)

责任编辑：张喜民

TheeffectsofKClstimulationontheexpressionofMKK4inglioblastomacells

HaoLingyun，YangXiaoxue，WangQinyue，SunMenglan，PanZhiqiang

XuzhouMedicalUniversity，JiangsuKeyLaboratoryofAnesthesiology，Xuzhou221002，China

ObjectiveTo observe the expression of MKK4 and its downstream protein p38 MAPK after stimulating human astrocytoma cells (U87) with different concentrations of KCl，and to explore the expression of MKK4 and p38 MAPK at the level of nucleic acid．MethodsU87 cells were stimulated with different concentrations of KCl，the expression of MKK4 and p38 MAPK mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)．The cells were divided into 5 groups：control group (group 0)，different concentrations of KCl group (0.001 mmol/mL，0.025 mmol/mL，0.05 mmol/mL，0.1 mmol/mL，labeled 0.001，0.025，0.05，0.1 group)．ResultsThe results of RT-PCR showed that MKK4 and p38 MAPK mRNA were expressed in astrocytes after stimulation with KCl，the expression was increase and then decrease and in the 0.05 group reached the peak，then fall．ConclusionKCl stimulation can increase the expression of MKK4 and p38 MAPK mRNA in human astrocytoma cells，and its expression is related to the concentration of KCl．

KCl；Astrocyte；MKK4；p38 MAPK

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.15.002

国家自然科学基金面上项目(81671096)；江苏省高校自然科学研究面上项目(16KJB320014)；徐州医科大学2014年度江苏省重点实验室开放课题(JSBL1404)

R-332

A

1673-5110(2017)15-0006-03

△通信作者：潘志强，男，副教授，博士。研究方向：疼痛信号转导。Email：307577660@qq．com