高效液相色谱法测定肝炎康胶囊中槲皮素含量

韦亚洁 ，李 平 ，2 ，秦 龙

（1.兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730030； 2.甘肃省消化系肿瘤重点实验室，甘肃 兰州 730030）

高效液相色谱法测定肝炎康胶囊中槲皮素含量

韦亚洁1，李 平1，2，秦 龙1

（1.兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730030； 2.甘肃省消化系肿瘤重点实验室，甘肃 兰州 730030）

目的建立测定肝炎康胶囊中槲皮素含量的高效液相色谱法。方法 色谱柱采用Zorbax Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流动相为甲醇 -0.1%磷酸（53∶47），流速为 1.0 mL／min，柱温为 30℃，检测波长为 360 nm，进样量为 5 L。结果 槲皮素质量浓度在 3.7 ～236.8 g／mL（r＝0.999 9）范围内与峰面积线性关系良好，平均回收率为 99.79% ，RSD 为 0.82% （n＝6）。结论 该方法准确性高、专属性强、重复性好，可用于肝炎康胶囊的质量控制。

肝炎康胶囊；槲皮素；高效液相色谱法

肝炎康胶囊是在我院常年使用的临床固定方基础上开发的医疗机构制剂，由虎杖、黄芪、太子参、半枝莲、白花蛇舌草、丹参、柴胡、水红花子等8味药材经水煎提取、干燥工艺制成的中药胶囊剂，具有益气固本、活血化瘀、利湿解毒的功效，主要用于治疗肝炎。其已建立了较为完善的质量标准体系，包括除水红花子外的7种药味的薄层色谱鉴别及大黄素的含量测定方法[1]。本制剂组方中白花蛇舌草、黄芪和水红花子均含有槲皮素（quercetin），且其活性与本制剂的临床主治相关。本研究中以槲皮素为检测指标，建立测定肝炎康胶囊中槲皮素含量的高效液相色谱（HPLC）法，拟在其质量标准中建立大黄素和槲皮素双成分含量限度指标，为进一步提高制剂的质量控制水平提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Mettler AB135-S型电子分析天平（十万分之一，瑞士梅特勒公司）；DHG-9147A型电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；KQ3200B型超声波清洗器（昆仑超声仪器有限公司）。

1.2 材料

槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，批号为10081-201610）；肝炎康胶囊（兰州大学第二医院自制制剂，批号为20170205）；药材由甘肃陇脉药材有限公司提供，经甘肃省中医药大学李成义教授鉴定与检验，均符合2015年版《中国药典（一部）》及相关地方药材标准规定。甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司禹城化工厂）；磷酸（分析纯，北京红星化工厂）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[2-4]

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -0.1% 磷酸（53 ∶47）；检测波长：360 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL ／min；进样量：5 μL。

2.2 溶液制备

对照品溶液：取槲皮素对照品适量，精密称定，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含370 μg的溶液，即得。

供试品溶液：取本品内容物适量，混匀，研细，取约1.24 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率为160 W，频率为50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：参照肝炎康胶囊处方及制法，依法制成缺白花蛇舌草、黄芪、水红花子的阴性供试样品，按供试品溶液项下方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取2.2项下3种溶液各5 μL，按拟订色谱条件注入液相色谱仪，测定。结果阴性对照品溶液色谱中，在与供试品溶液相同保留时间处未出现色谱峰，表明阴性对照品溶液无干扰，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密量取槲皮素对照品溶液0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.60，3.20 mL，分别置 5 mL 棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液。分别精密吸取各5 μL进样，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X，C）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y＝8.255 0 X-24.180， r＝0.999 9（n＝7）。结果表明，槲皮素质量浓度在 3.7 ～236.8 μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液各5 μL，在拟订色谱条件下连续进样6次。结果峰面积的平均值为60.322 2，RSD 为 1.16%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液各5 μL，分别于 0，1，2，3，4，5，6 h 时进样。结果槲皮素峰面积的平均值为 60.184 4，RSD 为 1.81% （n＝7），表明供试品溶液在6 h内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为20170205）的6份样品，每份约1.24 g，按供试品溶液制备方法制备，在拟订色谱条件下分别进样各5 μL，测定峰面积并计算槲皮素含量。结果肝炎康胶囊中槲皮素的平均含量为0.415 mg／g， RSD 为 1.88% （n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的肝炎康胶囊（批号为 20170205，含量为 0.415 mg／g）供试品溶液 6 份，分别按其槲皮素含量的80%，100%，120%精密加入槲皮素对照品溶液，摇匀。精密吸取上述溶液各5 μL，分别进样，测定峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 槲皮素加样回收试验结果(n＝6)

3 讨论

3.1 流动相考察

因加入适量的酸可以抑制槲皮素色谱峰的拖尾现象，故选用甲醇-磷酸体系。在参照文献[2-4]色谱条件的基础上，分别对甲醇 -0.1%磷酸（80∶20）、甲醇 -0.1% 磷酸（60 ∶40）、甲醇 -0.1% 磷酸（57 ∶43）、甲醇 -0.1% 磷酸（53 ∶47）、乙腈 -0.1% 磷酸（75 ∶25）和乙腈-0.1%磷酸（40∶60）等流动相体系进行比较。结果表明，在甲醇 -0.1%磷酸（53∶47）流动相下，色谱中槲皮素峰与相邻共存物质峰的分离度良好，峰形佳，槲皮素峰与相邻共存物质峰的分离度（R）均大于1.5，阴性无干扰。

3.2 柱温考察

对 25，30，35，40℃等不同柱温进行考察，结果表明，30℃时槲皮素与相邻共存物质峰能很好地分离且出峰较快，最终确定柱温为30℃。

3.3 样品处理方法考察

由于肝炎康胶囊内容物为水提取物，故选用供试样品加甲醇超声处理（功率为160 W，频率为50 kHz）30 min的方法处理样品。分别超声处理 15，30，45 min，按拟订色谱条件检测，结果表明，30 min时肝炎康胶囊中的槲皮素已提取较完全，故确定超声处理时间为30 min。

3.4 研究价值

建立肝炎康胶囊中槲皮素的含量测定方法，是基于多指标控制制剂质量的理念，即在已建立大黄素含量限度基础上增加槲皮素的含量测定项，提高质量控制水平。随着今后样品批次的增加和检测数据的累积，将进一步对槲皮素的含量限度进行研究和确定，加强对其质量标准的更新。

[1]王娟弟，李 平，秦 龙，等.肝炎康胶囊质量标准的建立[J].中国药师，2015，18（4）：559-663.

[2]白吉庆，王小平，李文连.青翘果实不同部位的有效成分比较分析研究[J].中成药，2012，34（3）：582-585.

[3]贝伟剑，罗 杰，吴爱銮，等.HPLC法测定柿叶浸膏中槲皮素和山奈酚[J].中草药，2005，36（7）:1014-1015.

[4]石继亮，单 玉，张振秋，等.HPLC法测定黄芪中槲皮素、山奈酚、芒柄花素的含量 [J].药物分析杂志，2010，30（1）：114-116.

Content Determination of Quercetin in Ganyankang Capsules by HPLC

Wei Yajie1,Li Ping1,2,Qin Long1
(1.Lanzhou University Second Hospital,Lanzhou,Gansu,China 730030;2.Key Laboratory of Digestive System Tumors,Lanzhou,Gansu,China 730030)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the content determination of quercetin in Ganyankang Capsules.Methods The Zorbax Eclipse XDB-C18column(250 mm × 4.6 mm,5 μm)was adopted with the mobile phase of methanol-0.1%H3PO4(53 ∶47)at flow rate of 1.0 mL ／min,the column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was set at 360 nm,the injection volume was 5 μL.Results The linear range of quercetin was 3.7-236.8 μg ／mL(r＝ 0.999 9)with an average recovery of 99.79%,RSD ＝0.82%(n ＝ 6).Conclusion The method is accurate,specific and reproducible,which can be used for the quality control of quercetin in Ganyankang Capsules.

Ganyankang Capsules;quercetin;HPLC

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2017)17－0021－03

10.3969 ／j.issn.1006-4931.2017.17.006

甘肃省自然科学基金[145RJZA207]；兰州大学第二医院2015年度院内博士基金[ynbskyjj2015-2-17]；兰州大学第二医院院内中医药科研项目[YJzy2013-26]。

韦亚洁，女，大学本科，副主任药师，讲师，研究方向为临床药学与中药制剂质量控制，（电话）0931-8942627（电子信箱）yajiewei＠ 163.com。

李平，男，博士研究生，硕士研究生导师，主任药师，研究方向为药物制剂，（电子信箱）gsliping＠163.com。

2017－05－16；

2017－06－28)