中空纤维离心超滤法研究乙醇对氨茶碱游离药物浓度的影响

周齐齐，高敬林，王新宇，杜朝辉，李梦娇，马海艳，蒋 晔

（河北医科大学药学院，河北 石家庄 050017）

中空纤维离心超滤法研究乙醇对氨茶碱游离药物浓度的影响

周齐齐，高敬林，王新宇，杜朝辉，李梦娇，马海艳，蒋 晔

（河北医科大学药学院，河北 石家庄 050017）

目的探讨乙醇对氨茶碱游离药物浓度的影响。方法 采用中空纤维离心超滤（HFCF-UF）前处理技术结合高效液相色谱（HPLC）法对氨茶碱游离药物浓度进行测定，并比较乙醇加入前后游离药物浓度的变化。结果 加入乙醇后氨茶碱游离药物浓度增加，且血浆乙醇浓度与游离药物浓度呈线性相关关系。结论 加入乙醇可能会影响血浆中的氨茶碱与血浆蛋白的结合，游离药物浓度增加，易出现毒副作用及毒性反应。

中空纤维离心超滤；乙醇；氨茶碱；游离药物浓度

血液中的药物通常以2种形式存在，部分与血浆蛋白结合，部分呈游离状态[1]。只有未与血浆蛋白结合的游离药物才是体内真正发挥药理效应的部分，其与药效及不良反应直接相关，尤其对于治疗窗窄、毒性大、蛋白结合率高的药物至关重要[2-3]。游离药物浓度极易受到多种因素的影响，目前仅关注疾病状态、合并用药等的影响[4]，而人们的日常生活习惯如吸烟、饮酒等的影响较易被忽视。氨茶碱(aminophylline，APY)为临床常用支气管扩张剂，其治疗窗窄(10 ～20 μg ／mL)，易出现毒副反应[5]，酒精中毒者慎用氨茶碱药物[6]，因此，本研究以氨茶碱为例，采用中空纤维离心超滤（HFCF-UF）技术结合高效液相色谱（HPLC）法对氨茶碱游离浓度进行测定，并进一步研究不同血浆乙醇浓度对游离药物浓度的影响规律，为药效的增强及药品不良反应的控制提供理论依据。

1 仪器与试药

UItiMate 3000型液相色谱仪，VWD-3100型紫外检测器(美国戴安公司)；H1650型台式离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；XW-80A型涡旋混合器(上海化科实验器材公司)；聚砜中空纤维(天津膜天膜科技股份有限公司，壁厚150 μm，截留相对分子质量10×103)；超滤玻璃管(天津永达仪器化工公司，高度7 cm，内径3 cm)。氨茶碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号为100121-201104)；无水乙醇（天津永达化学试剂有限公司）；空白血浆由河北省人民医院提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agela Innoval C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm Dikma)；流动相：甲醇 -0.01mol／L 醋酸铵（15∶85）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：274 nm；进样量：20 μL。

2.2 溶液配制

将 0.067 mol／mL 磷酸氢二钠溶液和 0.067 mol／mL的磷酸二氢钠溶液按4∶1的体积混合，加入适量氯化钠，使氯化钠浓度为 0.15 mol／mL，并用磷酸调 pH ＝7.4，得磷酸缓冲溶液(PBS)。

取氨茶碱对照品 5.06 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，用PBS稀释至刻度，得506 μg／mL的标准贮备液。将标准贮备液用PBS逐步稀释得质量浓度分别为25.300，10.100，5.050，2.020，1.010，0.505 μg ／mL 的系列标准溶液；同时制备 25.300，5.050，0.505 μg ／mL的质控血浆样品溶液。

2.3 血浆样品处理

将中空纤维剪成15 cm的小段，对折插入离心管中，另取血浆样品500 μL，置HFCF-UF装置中，37℃，3 500 r／min条件下离心15 min，取中空纤维内液20 μL，直接进样分析，得氨茶碱的游离药物浓度。

研究乙醇对氨茶碱游离药物浓度的影响时，取血浆样品 450 μL，置 1.5 mL 离心管中，分别加入 50 μL 不同质量浓度的乙醇溶液(5.00，10.00，50.00，100.00，250.00，500.00 g／L)，涡旋，制得质量浓度分别为 0.50，1.00，5.00，10.00，25.00，50.00 g ／L 的不同血浆乙醇浓度的样品溶液，置HFCF-UF装置中，3 500 r／min离心15 min，取中空纤维内液，直接进样分析。

2.4 统计学处理

采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。散点图用于描述氨茶碱游离药物浓度与血浆乙醇浓度的关系。

2.5 方法学考察

特异性试验：氨茶碱标准溶液、空白血浆及质控样品按2.3项下方法处理后，进样分析。在拟订色谱条件下，氨茶碱与血浆内源性杂质分离良好，不受内源性杂质的干扰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：取2.2项下系列标准溶液各20 μL，进样分析，以氨茶碱相应峰面积(A)与质量浓度(C)进行线性回归，得回归方程 A＝0.365 1 C+0.008 3，R2＝0.999 9(n ＝6)。结果表明，氨茶碱质量浓度在 0.505 ～25.300 μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

检测限和定量限确定：取线性最低点标准溶液逐倍稀释，按拟订色谱条件测定，以信噪比(S／N)为3和10计，计算氨茶碱的检测限和定量限，结果分别为0.202 μg ／mL 和 0.505 μg ／mL。

精密度试验：取 2.2 项下质量浓度为 0.505，5.050，25.300 μg／mL的质控血浆样品溶液，每个质量浓度制备5份，按血浆样品处理项进行操作，记录色谱峰面积，依法计算方法的回收率。以所得峰面积计算日内精密度；每个浓度连续测定5 d，计算日间精密度。结果表明，低、中、高 3个质量浓度的方法回收率为 98.2%～100.8%，日内、日间精密度的 RSD均小于2.3%(n＝5)。详见表1。

表1 HFCF-UF法测定氨茶碱游离药物浓度的回收率及精密度试验结果(n＝5)

稳定性试验：取 0.505，5.050，25.300 μg ／mL 3 个质量浓度的质控血浆样品溶液各5份，分别考察其置于室温下24 h及-70℃条件下保存3个月、3次冻融循环，以及经血浆样品处理后的超滤液在室温条件下放置24 h后的稳定性。结果的 RSD均小于7.5%(n＝5)，表明质控血浆样品溶液在上述条件下稳定性良好。

2.6 不同血浆乙醇浓度对氨茶碱游离药物浓度的影响

取适量氨茶碱标准品及空白血浆溶液，涡旋混匀，得 10.0 μg／mL 和 20.0 μg／mL 的质控血浆样品溶液。按2.3项下方法制备不同血浆乙醇浓度的质控血浆样品溶液，置超滤离心管中，3 500 r／min离心 15 min，超滤液进样分析，不同乙醇浓度重复5份，依法测定。由图2可知，在体外条件下，乙醇的加入可使氨茶碱游离药物浓度增加；血浆乙醇浓度与氨茶碱游离药物浓度呈正相关性，10.0 μg ／mL 和 20.0 μg／mL 的质控样品溶液，r分别为 0.993 和 0.997(P ＜0.000 1)。氨茶碱质控血浆样品(10.0 μg ／mL），随着血浆乙醇浓度从 0 增至

50 g／L，其相应的游离药物浓度增加1倍，接近氨茶碱游离药物浓度的有效治疗浓度最大值(8.00 μg／mL)，

不良反应的发生率增加；氨茶碱浓度为20.0 μg／mL的质控血浆样品溶液，其游离药物浓度本身为有效治疗浓度的最大值，乙醇加入量稍微增加，即使氨茶碱游离药物浓度超过有效治疗范围，出现了毒副反应。

图2 血浆乙醇浓度与氨茶碱游离药物浓度的相关性结果

3 讨论

3.1 乙醇对氨茶碱游离药物浓度的影响

饮酒往往会影响药物疗效，有时甚至增加药物的毒副作用[7-9]。文献[10-11]从乙醇影响药物代谢酶活性方面部分地阐释了乙醇对药物疗效及不良反应的影响机制，但人体对药物的处置较复杂，单从酶代谢方面阐述乙醇对药物的影响还不全面。贾昊迪等[12]报道了乙醇对绿原酸与牛血清白蛋白相互作用的影响，指出药物与白蛋白的结合常数和结合位点数均随着乙醇含量的增大而增加；闫华等[13]报道了乙醇对肉桂酸及黄酮类化合物与牛血清白蛋白结合的影响，指出乙醇的加入使结合常数和结合位点数减小。因此，乙醇进入机体后，可对肝微粒体药物代谢酶活性、药物-蛋白结合及对器官与组织的作用等多方面产生影响，使药物浓度及游离药物浓度发生变化，而游离药物浓度与毒副作用及不良反应有直接相关性。本研究结果表明，乙醇的加入可使氨茶碱游离药物浓度增加，同时血浆乙醇浓度与氨茶碱游离药物浓度呈正相关。血浆中游离药物浓度增加，不良反应的发生率增加，乙醇会影响药物的蛋白结合，从而影响药物的游离浓度，建议服药人群尽量避免饮酒。

3.2 乙醇加入量的选择

血中乙醇含量≥80 g ／100 L 时为醉酒状态[12，14]。同时，考虑到乙醇在机体内与药物的相互作用复杂，药物总浓度及游离浓度的变化可能受肝微粒体药物代谢酶、药物-蛋白结合及器官与组织等多方面因素影响。为了在体外条件下更好地观察乙醇浓度对游离药物浓度的影响规律，本研究中考察了大范围的乙醇加入量(0～50 g／L)。结果显示，血浆乙醇浓度与氨茶碱游离药物浓度呈正相关性，乙醇加入量的增加，使氨茶碱游离药物浓度增加，易发生毒副作用及毒性反应，提示饮酒量对药物疗效的影响，从而约束服药人群的饮酒行为。

3.3 非特异性结合(NSB)

NSB是膜超滤法常见的现象，可导致测定结果失真，因此考察了中空纤维对氨茶碱的NSB。取2.2项下低、中、高3个质量浓度的标准溶液，将500 μL该溶液置超滤管中，分别用聚偏氟乙烯、聚砜、聚酰胺3种材质的中空纤维在3 500 r／min下离心15 min，吸取中空纤维内液及外液20 μL进样，测得结果与同浓度的标准溶液比较，以回收率为指标。结果表明，3种材质的中空纤维所得内外溶液的回收率均在98.4%以上，故均不存在NSB问题。最终选用聚砜中空纤维用于后续试验。

3.4 研究价值

乙醇对血浆中氨茶碱游离药物浓度的影响规律，随着乙醇浓度的增高，游离药物浓度呈线性增加。本研究结果表明，药物与血浆蛋白的结合可能受到乙醇等因素的影响，蛋白结合率降低的同时游离药物浓度增大。对于治疗窗窄、毒性大且蛋白结合率高的药物，蛋白结合率微小变化就会引起游离浓度很大的变异，而游离药物浓度与药效及毒副作用直接相关。因此，研究乙醇对治疗窗窄、毒性大且蛋白结合率高的药物游离浓度的影响，对于药理学研究具有重要意义。

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Effects of Alcohol on Free Drug Concentration of Aminophylline by Hollow Fiber Centrifugal Ultrafiltration

Zhou Qiqi,Gao Jinglin,Wang Xinyu,Du Chaohui,Li Mengjiao,Ma Haiyan,Jiang Ye
(School of Pharmacy,Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei,China 050017)

ObjectiveTo investigate the effect of alcohol on free drug concentration of aminophylline.Methods Hollow fiber centrifugal ultrafiltration(HFCF-UF)combined with HPLC was adopted to determine the free drug concentration of aminophylline.The difference in free concentration before and after alcohol adding into the plasma was further compared to explore the impact on it of different alcohol concentrations.Results The free drug concentration of aminophylline increased with the addition of alcohol,meanwhile,there was a linear relationship between it and the alcohol concentration in plasma.Conclusion The addition of ethanol may affect the binding rate of aminophylline and plasma proteins in plasma,increase the free drug concentration,and prone to side effects and toxicity.

hollow fiber centrifugal ultrafiltration(HFCF-UF);alcohol;aminophylline;free drug concentration

R965；R969.2；R974+.3

A

1006-4931(2017)17-0014-03

10.3969 ／j.issn.1006-4931.2017.17.004

河北省省级大学生创业创新训练项目[USIP201533A]。

周齐齐（1994- ），女，大学本科，研究方向为药学，（电子信箱）785621123＠ qq.com。

蒋晔（1961-），男，教授，硕士研究生导师，研究方向为药物的质量控制，(电话)0311-86266069(电子信箱)jiangye＠hebmu.edu.cn。

2017－05－09)