超氧阴离子调节水稻幼苗不定根形成的分子机制

刘涛+郑欣+刘夏囡+高华健+车轩+周士钊+崔桂彩+赵凤云

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.014

摘要：用DR5-GUS转基因水稻分析O-2[KG-*2]· [KG-*3]对水稻幼苗叶鞘节处不定根原基形成、生长素分布及生长素和细胞周期基因表达的影响。结果显示，DDC（SOD抑制剂）处理加快了水稻幼苗叶鞘节处不定根原基的形成、生长和生长素在不定根根尖的积累，相反，Tiron（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除剂）处理则延缓了这一过程。DDC、Tiron处理条件下，水稻幼苗叶鞘节处分别有15个生长素基因（如[WTBX][STBX]OsYUCCA5、OsPIN9、OsARF2和OsIAA17[WTBZ][STBZ]等）和13个细胞周期基因（如[WTBX][STBX]Oryza；CycD4；1、Oryza；CycT1；3、Oryza；CDKC；3和Oryza；CDKF；1[WTBZ][STBZ]等）的表达存在明显差异，揭示 O-2[KG-*2]· [KG-*3]可能通过影响这些基因的表达而调控水稻不定根的形成和生长。结果说明， O-2[KG-*2]· [KG-*3]对水稻不定根形成的调节与其影响某些生长素和细胞周期基因的表达有密切关系。

关键词：不定根；超氧阴离子；水稻幼苗；叶鞘节

中图分类号： S511.01文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0054-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-03-15

基金项目：山东省自然科学基金（编号：ZR2014DM010、ZR2015CL009）；山东省淄博市科技发展计划（编号：111089、113106）。

作者简介：刘涛（1969—），男，山东淄博人，高级实验师，主要从事植物学研究。E-mail：liutao@sdut.edu.cn。

通信作者：赵凤云，博士，教授，主要从事分子生物学研究。E-mail：zfy1226@126.com。

[ZK）]

不定根是水稻根系的主要組成部分，对水稻的生长发育和产量有决定性的作用。种子根（初生根）和不定根具有不同的发育机制。在水稻不定根形成过程中生长素有重要的调节作用。生长素信号途径上关键基因如OsYUCs（生长素合成）、OsPINs（生长素运输）、OsAux/IAAs和OsARFs（生长素应答）[1-4]与水稻不定根的生长发育有密切关系。研究发现，生长素信号传导突变体不定根形成异常，如[WTBX][STBX]crown rootless1/ adventitious rootless1[WTBZ][STBZ]突变体不定根显著减少[5-6]。水稻[WTBX][STBX]OsRPK1[WTBZ][STBZ]基因负调控生长素的运输进而影响不定根的生长[7]。Liu等研究发现，OsGNOM1通过调节生长素运输基因如[WTBX][STBX]OsPIN2、OsPIN5b、OsPIN9[WTBZ][STBZ]的表达影响水稻不定根的形成[8]。细胞分裂是影响植物根系生长发育的重要过程。细胞周期调控受植物激素和多种信号分子的调节[9-14]。Lorbiecke等报道细胞周期调节水稻不定根的形成[15]。 O-2[KG-*2]· [KG-*3]是一种重要的信号分子，参与植物生长发育、激素应答、基因表达调控等众多过程。笔者的前期研究结果表明，Cd处理条件下， O-2[KG-*2]· [KG-*3]影响水稻根系的生长、生长素的分布和某些生长素和细胞周期基因的表达[10]。本试验进一步研究 O-2[KG-*2]· [KG-*3]调节水稻幼苗叶鞘节处不定根形成的分子机制。

1材料与方法

[HTK]1.1试验材料与处理[HT]

将[WTBX][STBX]DR5-GUS[WTBZ][STBZ]转基因水稻种子分别种植于含20 mmol/L Tiron（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除剂）和3 mmol/L DDC（SOD抑制剂）的固体MS培养基上，在培养箱内[光照度200 μmol/（m2·s）、14 h/d 光照、昼/夜温度27 ℃/21 ℃、昼/夜相对湿度60%/80%]培养3～5 d，每种处理独立重复3次。

1.2根系GUS活性组织化学分析

将上述培养3～5 d的幼苗进行GUS活性检测[16]，每种处理至少用20株。

1.3不定根和叶鞘节横切片不定根原基的统计

不定根数量在解剖镜下统计，不定根原基在显微镜下观察拍照并统计，每种处理取20个叶鞘节做冰冻横切片（厚度35 μm），每个叶鞘节至少统计5张切片。数据用每株的平均值来表示。

1.4叶鞘节生长素和细胞周期基因表达分析

上述幼苗处理4 d后取叶鞘节进行基因转录分析。使用Trizol试剂从每种处理的叶鞘节提取总RNA，取1 μg总RNA，用RNA PCR试剂盒（AMV）V3.0合成cDNA。每种处理用等量的cDNA进行PCR反应，用25 μL PCR产物进行检测，每个PCR反应在相同条件下独立重复3次。用[WTBX][STBX]Osactin1[WTBZ][STBZ]基因作为内标，采用Gel-Pro Analyzer软件对基因转录活性进行半定量分析，将对照的转录水平设置为1，基因表达水平≥1.3为表达上调，≤0.7为表达下调。

1.5数据统计分析

每种处理数据用SPSS 16.0软件进行统计分析，P<0.05 为差异显著，用3次独立重复试验的平均值和标准误差来表示试验结果。

2结果与分析

2.1 O-2[KG-*2]· [KG-*3]对水稻幼苗不定根及其原基总和的影响

在水稻幼苗处理3～5 d期间，DDC处理的不定根及其原基的总和较对照的多，相反，Tiron处理较对照的少（图1）。[JP3]如处理4 d时，DDC处理不定根及其原基的总和比对照多75.7%（P<0.05），而Tiron处理比对照少29.8%（P<005）。[JP]endprint

[FK（W12][TPLT1.tif][FK）]

[HTK]2.2 O-2[KG-*2]· [KG-*3]对水稻幼苗不定根原基形成和生长素积累的影响[HT]

DDC和Tiron处理3～5 d后不定根原基形成和生长素积累的动态变化存在明显差异（图2）。与对照相比，DDC加快不定根原基的形成和生长素在根尖的积累，而Tiron延迟不定根原基的形成和生长素在不定根的积累。

2.3 O-2[KG-*2]· [KG-*3]对水稻幼苗叶鞘节生长素基因表达的影响

生长素在不定根的形成和生长过程中具有重要作用，为进一步了解生长素基因表达与不定根形成之间的关系，本试验进一步分析了水稻幼苗处理4 d后叶鞘节处生长素信号途径上关键基因的转录活性。在所检测的69个生长素基因中有15个基因的表达水平在DDC、Tiron处理条件下存在明显差异（图3）。其中DDC处理时，有10个生长素基因（[WTBX][STBX]OsYUCCA5、OsPIN1a、OsARF1、OsARF2、OsARF4、OsARF20、OsARF24、OsIAA7、OsIAA15、OsIAA17[WTBZ][STBZ]）的转录水平高于对照，有2个基因（[WTBX][STBX]OsYUCCA2和OsYUCCA6[WTBZ][STBZ]）的转录水平低于对照；Tiron处理时，[WTBX][STBX]OsYUCCA2、OsYUCCA6、OsPIN9、OsPIN10b[WTBZ][STBZ] 等4个生长素基因的表达水平比对照高，而[WTBX][STBX]OsARF18[WTBZ][STBZ]转录水平比对照低。生长素应答是调节植物生长发育的重要过程，值得注意的是在这些差异表达的基因中DDC处理促进了生长素应答基因（OsARFs/OsIAAs）的表达。该结果说明， O-2[KG-*2]· [KG-*3]对水稻不定根原基形成的影响与其调节部分生长素基因的表达有关。

2.4 O-2[KG-*2]· [KG-*3]对水稻幼苗叶鞘节细胞周期基因表达的影响

细胞分裂是不定根形成所必需的过程，试验进一步分析了水稻幼苗处理4 d后叶鞘节处细胞周期核心基因表达的变化。在所分析的52个细胞周期基因中有13个基因的转录活性在DDC、Tiron处理条件下存在明显差异（图4）。与对照相比，DDC处理激活了8个细胞周期基因（[WTBX][STBX]Oryza；CycD7；1、Oryza；CycT1；3、Oryza；CDKC；3、Oryza；CDKE；1、Oryza；CDKF；1、Oryza；CDKF；3、Oryza；CDKF；4和Oryza；CDKG；1[WTBZ][STBZ]）的转录，抑制了1个基因（[WTBX][STBX]Orysa；CycD5；1[WTBZ][STBZ]）的转录（图4）；Tiron处理提高了5个基因（[WTBX][STBX]Oryza；CycB1；2、Oryza；CycD2；1、Oryza；CycD4；1、Orysa；CycD5；1和Oryza；CDKC；1[WTBZ][STBZ]）的表达水平。细胞周期蛋白激酶（CDKs）是促进细胞分裂进程的关键酶。值得注意的是DDC处理激活了细胞周期蛋白激酶基因（Oryza；CDKs）的转录。该结果说明， O-2[KG-*2]· [KG-*3]通过影响这些细胞周期基因的表达对水稻不定根原基的形成进行了调节。

[FK（W14][TPLT4.tif][FK）]

3讨论

O-2[KG-*2]· [KG-*3]是调节根系生长发育的重要信号分子[10]。本研究中DDC处理加快了水稻幼苗叶鞘节处不定根原基的形成、生长和生长素在不定根根尖的积累，相反，Tiron处理则延缓了这一过程（图1、图2），说明 O-2[KG-*2]· [KG-*3]在调节水稻不定根生长发育过程中有重要的作用。生长素和细胞周期是调控水稻不定根形成的关键因素[5-8，15]。生长素应答基因（OsARFs/OsIAAs）是生长素信号传导网络的组成部分，与众多植物生长发育过程有关。细胞周期蛋白激酶（CDKs）是控制细胞分裂进程的核心酶之一。本试验中DDC、Tiron处理条件下，水稻幼苗叶鞘节处某些生长素基因特别是生长素应答基因（OsARFs/OsIAAs）和细胞周期基因尤其是细胞周期蛋白激酶基因（Oryza；CDKs）的表达有明显差异（图3、图4），DDC明显促进了这些基因的表达，揭示 O-2[KG-*2]· [KG-*3]可能通过影响这些基因的表达而调控水稻不定根的形成和生长。综合本试验结果， O-2[KG-*2]· [KG-*3]调节不定根形成的分子机制概括如图5所示：（1） O-2[KG-*2]· [KG-*3]通过直接影响某些生长素、细胞周期基因的表达来调控不定根的形成；（2） O-2[KG-*2]· [KG-*3]通过生长素信号调节细胞周期基因的表达进而影响不定根的形成。当然，不能排除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]通过其他途径影响生长素、细胞周期基因的表达，由此调控不定根的形成。关于 O-2[KG-*2]· [KG-*3]调节水稻不定根形成的其他途徑有待于进一步研究。

参考文献：

[1][ZK（#]Yamamoto Y，Kamiya N，Morinaka Y，et al. Auxin biosynthesis by the YUCCA genes in rice[J]. Plant Physiol，2007，143（3）：1362-1371.[ZK）][HT][HJ]

[2][ZK（#]Wang D K，Pei K M，Fu Y P，et al. Genome-wide analysis of the auxin response factors（ARF）gene family in rice（Oryza sativa）[J]. Gene，2007，394（1/2）：13-24.endprint

[3]Wang J R，Hu H，Wang G H，et al. Expression of PIN genes in rice （Oryza sativa L.）：tissue specificity and regulation by hormones[J]. Mol Plant，2009，2（4）：823-831.

[4]Song Y L，Wang L，Xiong L Z. Comprehensive expression profiling analysis of OsIAA gene family in developmental processes and in response to phytohormone and stress treatments[J]. Planta，2009，229：577-591.

[5]Inukai Y，Sakamoto T，Ueguchi-Tanaka M，et al. Crown rootless1，which is essential for crown root formation in rice，is a target of an AUXIN RESPONSE FACTOR in auxin signaling[J]. Plant Cell，2005，17（5）：1387-1396.

[6]Liu H J，Wang S F，Yu X B，et al. ARL1，a LOB- domain protein required for adventitious root formation in rice[J]. Plant Journal，2005，43（1）：47-56.

[7]Zou Y，Liu X Y，Wang Q，et al. OsRPK1，a novel leucine-rich repeat receptor-like kinase，negatively regulates polar auxin transport and root development in rice[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2014，1840（6）：1676-1685.

[8]Liu S P，Wang J R，Wang L，et al. Adventitious root formation in rice requires OsGNOM1 and is mediated by the OsPINs family[J]. Cell Res，2009，19：1110-1119.

[9]Burssens S，de Almeida-Engler J，Beeckman T，et al. Developmental expression of the [WTBX][STBX]Arabidopsis thaliana CycA2；1[WTBZ][STBZ] gene[J]. Planta，2000，211（5）：623-631.[ZK）]

[10][ZK（#]Zhao F Y，Hu F，Han M M，et al. Superoxide radical and auxin are implicated in redistribution of root growth and the expression of auxin and cell-cycle genes in cadmium-stressed rice[J]. Russian J Plant Physiol，2011，58（5）：851-863.

[11]Zhao F Y，Han M M，Zhang S Y，et al. Hydrogen peroxide-mediated growth of the root system occurs via auxin signaling modification and variations in the expression of cell-cycle genes in rice seedlings exposed to cadmium stress[J]. J Integr Plant Biol，2012，54（12）：991-1006.

[12]Zhao F Y，Hu F，Zhang S Y，et al. MAPKs regulate root growth by influencing auxin signaling and cell cycle-related gene expression in cadmium-stressed rice[J]. Environ Sci Pollut Res，2013，20（8）：5449-5460.[ZK）][HT][HJ][HT][FL）]

[KH*4D]

[HT8.]

[13][ZK（#]Zhao F Y，Wang K，Zhang S Y，et al. Crosstalk between ABA，auxin，MAPK signaling，and the cell cycle in cadmium-stressed rice seedlings[J]. Acta Physiol Plant，2014，36（7）：1879-1892.

[14]Lorbiecke R，Sauter M. Adventitious root growth and cell-cycle induction in deepwater rice[J]. Plant Physiol，1999，119（1）：21-30.

[15]Petersson S V，Johansson A I，Kowalczyk M，et al. An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis[J]. Plant Cell，2009，21（6）：1659-1668.endprint