国内外苜蓿品种遗传多样性RAPD分析

王健胜+侯桂玲+谢永凤

摘要：采用随机扩增多态性DNA（RAPD）标记对19份国内外苜蓿种质的遗传多样性进行分析。结果显示，7对RAPD引物在供试苜蓿材料中共获得有效扩增位点51个，其中多态性位点50个，多态性位点百分率为98.04%。引物的有效等位基因数、Neis基因多样性指数、Shannons信息指数和多态性信息含量平均分别为1.48个、0.29、0.44和0.33。供试苜蓿材料间的遗传相似系数介于0.039～0.922之间，平均为0.494。聚类分析和主成分分析均表明，供试苜蓿种质可被划分为两大类，其中第一类群包括的苜蓿种质数最多，达到16个，占所有供试苜蓿种质数的84.21%。研究结果将为供试苜蓿种质有效利用提供一定科学依据。

关键词：苜蓿；遗传多样性；RAPD分析

中图分类号： S551+.703文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0035-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-03-15

基金项目：河南省科技攻关项目（编号：KJT142102110171）；河南省平顶山市科技计划（编号：2014086）。

作者简介：王健胜（1978—），男，陕西礼泉人，博士，讲师，主要从事作物遗传育种研究。E-mail：wjsheng1998@163.com。

[ZK）]

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是多年生同源四倍体（2n=4x=32）和异花授粉植物，也是世界上最重要的豆科牧草之一，被誉为“牧草之王”[1]。紫花苜蓿在我国的栽培历史较长，其栽培面积也是牧草中最大的。近年来，随着人们对苜蓿产业发展的逐步重视，我国不断加强了国外苜蓿引种和种质资源交流，这为我国苜蓿相关研究提供了较为丰富的种质资源。但是，引种和品种资源交流频率的增加造成了现有苜蓿品种在名称和来源上的混乱，品种及种质的产权问题、种子质量问题也越来越严重，而且至今未能建立起有效的鉴别方法和标准，这也在一定程度上限制了优良种质资源的进一步开发利用。因此，开展苜蓿种质资源研究显得尤其重要。

分子标记技术作为重要研究手段在植物种质资源研究中得到了极为广泛的应用，但与其他主要农作物相比，利用分子标记开展苜蓿种质资源的研究仍较少。由于苜蓿分子标记研究起步较晚，导致苜蓿专有分子标记开发数量较少，因此现有苜蓿研究中利用的分子标记主要以随机标记为主。目前，包括扩增片段长度多态性（AFLP）[2]、微卫星（SSR）[3-4]、微卫星间隔（ISSR）[5-6]等多种类型分子标记都较好地被应用于苜蓿种质资源研究中。随机扩增多态性DNA（RAPD）标记是一种较早开发的分子标记技术，由于它具有易扩增、多态性高、操作简便、无种属限制等优点而被广泛应用于苜蓿遗传多样性研究中[7-9]。因此，本研究采用RAPD分子标记技术对国内外的19份苜蓿栽培种质进行了遗传多样性分析，在初步掌握不同苜蓿种质间亲缘关系的同时， 发现具有优良变异的苜蓿种质，为我国苜蓿种质的科学鉴定、保护和高效利用提供一定的基础。

1材料与方法

[HTK]1.1试验材料[HT]

供试材料基本信息见表1。

1.2DNA提取

每份材料随机选取10～15个单株幼嫩叶片等量混合，采用改良的十二烷基硫酸钠（SDS）法[10]混合提取基因组总DNA，经紫外分光光度计测定浓度后，稀释至适合浓度用于苜蓿基因组PCR扩增检测。

1.3RAPD标记检测

PCR扩增反应在Eppendorf PCR扩增仪上完成。PCR反应总体积为20 μL，包括1.5 μL基因组DNA（40 ng），1.5 μL引物（20 mmol/L），2.0 μL10×PCR缓冲液（含Mg2+），2.0 μL 底物dNTPs（2.5 mmol/L），1.0 μL Taq酶（2 U/μL）和12 μL ddH2O。本研究用的RAPD引物相关信息见表2。

RAPD-PCR扩增程序：3个循环（94 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min）；37个循环（94 ℃ 30 s，37 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min）； 最后72 ℃ 5 min。 扩增产物用浓度为 1.8% 的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并在紫外凝胶成像系统上保存分析，同时为了保证试验的准确性，每个RAPD反应都需要重复3次以上。

1.4数据统计及分析

以0、1、9统计SCOT扩增带型，在相同迁移率位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，缺失记为“9”，并建立分子数据矩阵。利用NTSYS-pc2.10软件通过非加权平均法（UPMGA）计算苜蓿种质间的遗传相似系数，并在此基础上作聚类分析及主要成分分析。采用POPGEN32软件估算SCOT标记的主要遗传多样性参数，包括引物扩增总条带数（TNB）、多态性条带数（NPB）、多态性条带百分率（PPB）、有效等位基因数（Ne）、Neis基因多样性指数（H）、Shannons信息指数（I）和多态性信息含量（PIC）。

2结果与分析

2.1苜蓿种质RAPD多态性分析

利用筛选出的多态性表现较好的7个RAPD引物对苜蓿种质群体进行了检测分析。由表3可见，不同RAPD引物对苜蓿基因组的扩增存在较大差异，单个RAPD引物扩增条带数分布在3～12个，平均为7.29个，多态性条带数分布在 2～12个，平均为5.14个。在所利用的RAPD引物中，除OPA13外，其余引物的多态性条带百分率均为100.00%，所有引物多态性条带百分率平均达到了95.24%。不同标记间的遗传参数差异也较大。有效等位基因数分布在1.32～167個，平均为1.48个；Neis基因多样性指数的分布范围是0.23～0.38，平均为 0.29；所有引物的Shannons信息指数都较高，其分布范围在0.38～0.55，平均为0.44。多态性信息含量是衡量分子标记有效性的重要指标之一，从表3不难看出，不同RAPD标记的多态性信息含量差异较大，其分布范围在0.23～0.41，平均为0.33。endprint

2.2不同苜蓿种质亲缘关系分析

由表4可见，不同苜蓿种质间遗传相似系数差异较大。苜蓿种质3与15间的遗传相似系数最小，只有0.039，表明这2个苜蓿种质间的亲缘关系最远；种质6与7间的遗传相似系数最大，达到了0.922，表明与其他苜蓿种质相比，这2个苜蓿种质间具有较近的亲缘关系。同时可以看出，所有苜蓿种质平均遗传相似系数较低，只有0.494，表明供试苜蓿种质整体遗传差异水平较高，在未来苜蓿遗传育种相关研究中具有较好的利用前景。

2.3不同苜蓿种质聚类分析

基于RAPD标记检测获得的遗传相似系数对19份苜蓿种质进行了聚类分析，由图1可知，19份苜蓿种质在遗传系数0.420处可被划分为2个大类，第1类群包括的苜蓿种质数最多，达到了16个，占供试苜蓿种质总数的84.21%，其中国内苜蓿种质11个，国外苜蓿种质5个；第2类群包含的苜蓿种质数只有3个，均来自国内，系数分别是0.844 0、0.844 3 和0.844 6。根据第1类群中苜蓿种质亲缘关系的远近，该类群在遗传相似系数0.573处又可划分为2个亚群，第1亚群共包括8个苜蓿种质，其中有3个国外种质，5个国内种质，第2亚群也由8个苜蓿种质构成，除赛迪7和游客外，其余均为国内苜蓿种质。

2.4苜蓿种质主成分分析[HT]

以RAPD标记检测数据为基础，对19份苜蓿种质进行了主成分分析，具体分析结果见图2。在主成分分析中，前3个主成分能解释的总遗传变异较高，达50.99%。从图2可以看出，主成分分析获得了与聚类分析完全一致的结果，聚类分析中被聚为同一类群的苜蓿种质在主成分分析中也被划分为一类，由此可见，主成分分析结果也在一定程度上准确反映了不同苜蓿种质间的亲缘关系。

3讨论

苜蓿种质资源研究一直备受重视[11-12]，利用不同类型的分子标记，许多学者对不同苜蓿种质资源开展了较多的研究，其中RAPD标记是应用最早且应用频率较高的分子标记之一。为了获得苜蓿基因组理想的扩增效果，袁庆华等针对RAPD反应条件进行了专门的优化筛选探索[13-15]，这些研究结果也進一步促进了RAPD在苜蓿研究中的有效应用。本研究利用多态性表现良好的RAPD标记对19份国内外苜蓿种质进行了分析，7个RAPD标记共获得51个有效扩增位点，其中多态性位点50个，多态性位点百分率达到 98.04%。杨晓莉等利用10个RAPD引物在11个苜蓿栽培品种中扩增获得了811%的多态性位点百分率[16]，蒿若超等用35个RAPD引物对53份苜蓿进行分析，获得的多态性位点百分率为9412%[17]，王赫等在利用RAPD引物进行苜蓿种质多样性分析中仅获得了74.5%的多态性位点百分率[18]。通过比较不难看出，不同研究中RAPD标记对苜蓿基因组的扩增效果差异较大，而本研究获得的多态性位点百分率相对最高，究其原因，除了不同研究中利用的RAPD标记序列不同外，苜蓿种质的差异也是重要影响因素之一。[JP]

分子标记应用中多样性参数分析不仅有利于我们掌握分子标记对苜蓿基因组检测的有效性，同时也能在一定程度上反映所研究苜蓿种质遗传多样性状况。在以往的利用RAPD标记进行苜蓿种质遗传多样性研究中，有关RAPD标记多样性参数分析的报道甚少。本研究对所利用的RAPD标记的4种主要多样性参数作了分析，结果发现，RAPD标记的主要多样性参数表现均较好，其中有效等位基因数平均为1.48个，Neis 基因多样性指数平均为0.29，Shannons信息指数平均为0.44，多态性信息含量平均为0.33。

以RAPD标记检测结果为基础，本研究对供试苜蓿种质的遗传多样性及亲缘关系作了分析。结果发现，供试苜蓿种质的遗传多样性较丰富，其平均遗传相似系数只有0.494，在聚类分析中，19份苜蓿种质可被划分为2个大类，该聚类分析结果已经清楚地反映了不同苜蓿种质间亲缘关系的状况。在未来苜蓿种质资源利用中，我们应当以此为基础，选择亲缘关系远、农艺性状表现良好且互补的苜蓿种质作为育种亲本配制杂交组合，只有这样，才能有效提高苜蓿优良新品种培育的效率和水平。

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