丙氨酸对林可霉素发酵的影响

孙玉杰，杨淑慎，张 琪，武 培，魏 娟

(1.西北农林科技大学,陕西 杨凌 712100;2.天方药业有限公司,河南 驻马店 463000)

丙氨酸对林可霉素发酵的影响

孙玉杰1,2，杨淑慎1*，张 琪2，武 培2，魏 娟2

(1.西北农林科技大学,陕西杨凌712100;2.天方药业有限公司,河南驻马店463000)

在林可链霉菌发酵产林可霉素的过程中添加丙氨酸有利于林可霉素的生物合成。在摇瓶发酵过程中，于发酵开始24h向发酵培养基中添加0.02%的丙氨酸，林可霉素的效价提高了15%；放大至15L发酵罐，成功验证了丙氨酸对林可霉素生物合成的促进作用，发酵罐放罐效价达5300U/mL,比对照罐效价提高了20%。通过检测发酵液中的丙酮酸发现，丙酮酸可能抑制了磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸转化，使菌体内积累高浓度磷酸烯醇式丙酮酸，进而提高林可霉素的产量。

林可链霉菌；丙酮酸激酶；丙氨酸

林可霉素(Lincomycin)具有较好的抗革兰阳性菌的能力，它与已知的抗生素间不存在交叉耐药性，并且毒性很低、抗菌活性更强，因此林可霉素和它的衍生物盐酸林可霉素已经广泛用于医疗卫生行业[1]。林可霉素是在美国林肯市的土壤中发现的由林可链霉菌林可变种所产生的一类能抑制细菌的蛋白质合成，对大多数革兰阳性菌和某些厌氧的革兰阴性菌有抗菌作用的抗生素。在林可霉素发酵生产过程中除主要产生林可霉素A组分外，还伴有少量的林可霉素B组分。林可霉素及其下游半合成产品称为林肯酰胺类抗生素。林肯酰胺类抗生素已成为临床应用上主要的抗生素之一[2]。

目前国内外学者对林可霉素的生物合成进行了多方面优化研究，当然也取得了一定成果。例如：周晓芳等[3]用棉籽蛋白粉和花生粉替代林可链霉菌培养基中的黄豆饼粉，用响应面分析法优化了林可链霉菌的发酵培养基，用优化后的发酵培养基培养林可链霉菌，林可霉素的产量提高了12%～17%。李啸等[4]人在林可链霉菌的发酵培养基中添加氨基酸和生物素，使林可霉素的产量提高了42%。汤海云等[5]人在林可链霉菌的发酵培养基中添加了不同浓度、不同种类的金属离子，使林可霉素的产量提高了20%。

本文通过摇瓶发酵培养考察不同浓度的丙氨酸、丙氨酸不同添加时间对林可霉素产量的影响，并扩大到15L发酵罐进行验证，同时检测发酵液中丙酮酸的浓度，以明确丙氨酸对林可霉素生物合成的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验用菌种

Js0215-03F1

1.1.2 培养基

种子培养基(%)

玉米淀粉2，黄豆饼粉(生)2，葡萄糖1，玉米浆4，(NH4)2SO40.2，CaCO30.4，pH值:6.8。

发酵培养基(%)

黄豆饼粉(生)2.5，葡萄糖12，玉米浆0.4，(NH4)2SO40.8，NaCl 0.8， K2HPO40.025，NaNO30.6，CaCO30.8，pH值:7.2。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

1.2.1.1 摇瓶培养

摇瓶种子培养：挖斜面培养基1cm2左右的菌块，接种到装有50mL种子培养基的500mL的三角瓶中，29℃条件下，230 r/min摇床振荡培养48h。

摇瓶发酵培养：将培养好的种子液按10%的接种量移种到装有30mL发酵培养基的250mL的三角瓶中，29℃条件下，230r/min摇床振荡培养7d。

1.2.1.2 15L发酵罐培养

发酵罐所需要的一级种子培养方法和摇瓶种子培养方法相同，二级种子培养24h。

将二级种子液以10%的接种量接入装有发酵培养基的15L发酵罐中。控制好发酵温度29℃，转速120r/min，风量：0.5vvm。发酵24h起每隔4h补一次料，以满足发酵过程中菌种对营养物质的需求。

1.2.2 丙氨酸对发酵培养基中林可霉素产量的影响

1.2.2.1 摇瓶发酵培养基中丙氨酸最适添加浓度的确定

在摇瓶发酵开始0h时分别向发酵培养基中添加浓度为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的丙氨酸作为实验组，以不添加丙氨酸的作为对照组，进行放瓶摇瓶中林可霉素含量的测定，对比放瓶效价，来确定摇瓶发酵培养中丙氨酸的最适添加浓度。

1.2.2.2 摇瓶发酵培养基中丙氨酸最适添加时间的确定

在发酵摇瓶中分别于24,48,72,96,120h和144h添加0.02%的丙氨酸作为实验组，以不添加丙氨酸的作为对照组，进行放瓶效价的比较，以确定发酵摇瓶培养基中丙氨酸的最适添加时间。

1.2.2.3 15L发酵罐进行不添加丙氨酸(对照组)和在发酵24h添加浓度为0.02%的丙氨酸(实验组)的发酵培养，一定发酵时间取样，通过比较放罐效价以及发酵过程中丙酮酸的含量变化，进一步确定丙氨酸对林可霉素合成的影响。

1.2.3 测定方法

1.2.3.1 生物效价

生物效价的测定方法：见中国药典[6]。

1.2.3.2 丙酮酸的测定

采用高效液相色谱法检测发酵液中丙氨酸浓度。

2 结果与分析

2.1 不同浓度丙氨酸对林可霉素产量的影响

中日医院呼吸中心烟草病学与戒烟中心主任肖丹教授说，虽然理论上电子烟的危害应比普通卷烟略小，但依然含有尼古丁、丙二醇、丙三醇、重金属等有害物质，会增加患慢性阻塞性肺疾病、肺癌、心血管疾病的风险，只要接触人体就会带来安全隐患。

在发酵开始时向发酵摇瓶培养基中加入不同浓度的丙氨酸，考察林可霉素产量的变化，具体结果见图1。

图1 添加不同浓度丙氨酸对林可霉素合成的影响

从图1可知，在摇瓶发酵0h时，当丙氨酸的添加浓度为0.02%时，林可霉素摇瓶发酵效价达到了4210U/mL，比对照组效价提高了20%，可能原因是只有在丙氨酸的添加浓度合适的情况下，才会对林可霉素的效价产生正影响。

2.2 丙氨酸不同添加时间对林可霉素效价的影响

在摇瓶发酵培养基中分别在发酵的不同时间点添加0.02%的丙氨酸，以不添加丙氨酸的作为对照，发酵结束后，摇瓶效价测定结果如图2所示。

图2 在不同时间添加丙氨酸对林可霉素效价的影响

从图2可以看出，当24h添加一定浓度的丙氨酸时，其效价达到3950U/mL,比对照组的3400U/mL提高了15%。可能原因是在发酵24h时，丙氨酸抑制磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的转化，从而提高林可霉素的效价。

2.3 15L发酵罐中添加丙氨酸对林可霉素效价的影响

前期摇瓶实验证明，在摇瓶发酵过程中，于发酵24h向发酵培养基中添加0.02%的丙氨酸，林可霉素的效价提高了15%。以此浓度和添加时间为基点放大至15L发酵罐，分析放罐效价，进一步确定丙氨酸对林可霉素合成的影响。实验结果如图3所示。

图3 15L发酵罐中添加丙氨酸对林可霉素效价的影响

图3表明，当向发酵培养基中添加了丙氨酸之后，林可霉素的效价有了明显提高，放罐效价达到5300U/mL,比没有添加丙氨酸的对照罐提高了20%。

2.4 15L发酵罐中添加丙氨酸对丙酮酸含量的影响

15L发酵罐发酵培养林可霉素时，按一定时间点取样，采用高效液相色谱法测定发酵液中丙酮酸的含量。实验结果如图4所示。

图4 丙酮酸在发酵过程中含量的变化

图4可以看出，在发酵中后期，处理组和对照组的丙酮酸含量有明显的差异，可能是因为，添加了丙氨酸的处理组抑制了磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的转化，才会使得发酵过程中丙酮酸的积累量相对于对照组降低。

3 结论

在摇瓶发酵过程中，于发酵开始时24h向发酵培养基中添加0.02%的丙氨酸，林可霉素的摇瓶效价提高15%，放大至15L发酵罐，验证了发酵培养过程中添加丙氨酸可大幅度提高林可霉素的效价，使得放罐效价达到5300U/mL,比对照罐效价提高了20%。同时采用高效液相色谱法检测发酵液中丙酮酸的含量，发现丙氨酸作为林可霉素代谢途径中关键酶的抑制剂，能够对林可霉素的合成产生重要影响。

[1] 丁 琳.复合诱变选育林肯霉素高产菌株[J].基酸和生物资源，2006，28(4)68-70.

[2] Wright J L C.The lincomycin-celesticetin-anthramycin group[M]// Vining L C .Biochemistry and Genetic Regulation of Commercially Important Antibiotics, London: Addison-Wesley Publishing Company ,1983.

[3] 周晓芳，叶蕊芳，储成亮,等林可霉素生物合成培养基的优化[J].工业微生物，2011，41(2)：21-25.

[4] 李 啸，储 矩，张嗣良,等.生物素和氨基酸对林可霉素生物合成的影响[J]中国抗生素杂志，2008，33(1)：6-10.

[5] 汤海云，李 啸，储 矩,等.金属离子对林可霉素合成的影响[J].中国抗生素杂志，2007，32(12)：723-726.

[6] 国家药典委员会.ChP 中国药典(二部)[M].北京：中国医药科技出版社, 2010.

(本文文献格式：孙玉杰，杨淑慎，张琪，等.丙氨酸对林可霉素发酵的影响[J].山东化工，2017，46(16)：9-10,12.)

The Effect of Alanine on the Fermentation of Lincomycin

Sun Yujie1,2，Yang Shushen1*，Zhang Qi2，Wu Pei2，Wei Juan2

(1 .Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2 .Topfond Pharmaceutcal Co.,Ltd., Zhumadian 463000, China)

This topic is mainly used in the process of lincomycin, which can be used to make the biosynthesis of lincomycin. During the fermentation process, the effect price of lincomycin was increased by 15% by adding 0.02% of alanine to the fermentation medium during the fermentation period. It was amplified to 15L starter, successfully validating the effect of alanine on the biosynthesis of lincomycin, and the efficiency of the pot was up to 5300U/mL, which was 20% higher than that of the control pot.Pyruvic acid in the fermented liquid through testing found that pyruvate may inhibit the pyruvate kinase in the glycolytic pathway of enzyme activity, thus inhibiting the enol phosphate type pyruvate to pyruvic acid, make the bacteria in the body accumulation of high concentrations of enol phosphate type pyruvic acid, and improve the output of lincomycin.

streptomyces lincolnensis; pyruvate kinase;alanine

TQ465

：A

：1008-021X(2017)16-0009-02

2017-06-16

陕西省社会发展科技攻关项目(2015SF308，野生名贵植物红豆杉产天然抗癌药物紫杉醇的研究)

孙玉杰(1986—)，女，河南驻马店人，主要从事林可霉素、红霉素等菌种选育的研究；通讯作者：杨淑慎(1956—)，女，西北农林科技大学生命科学院学院教授，博士，博士生导师，九三学社社员，主要从事植物抗逆生理、植物细胞培养工程方面的研究工作。