亲子鉴定中46，XX性发育异常1例

张应爱，王顺兰，何浩伟，陈 扬，罗思琴，张淑芳，黄群生

（1.海口市人民医院中心实验室，海南 海口570208；2.海南司法医院法医鉴定中心，海南 海口571100）

亲子鉴定中46，XX性发育异常1例

张应爱1，王顺兰1，何浩伟1，陈 扬1，罗思琴1，张淑芳1，黄群生2

（1.海口市人民医院中心实验室，海南 海口570208；2.海南司法医院法医鉴定中心，海南 海口571100）

法医遗传学；亲子关系；46，XX性发育障碍

1 案 例

1.1 简要案情

自称父亲的男子（假定父）以给孩子落户为名，携妻子（假定母）和女儿及有效证件来本鉴定中心进行亲子鉴定。根据知情同意原则，采集血样备检。

1.2 检验方法

1.2.1 DNA检验

采用常规Chelex-100法分别提取假定父母和孩子待检血样的DNA，使用PowerPlex®21试剂盒（美国Promega公司）进行PCR复合扩增，对三人进行基因分型检测。采用AGCU Y18 STR和AGCU X12 STR荧光检测试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司）对假定父18个Y-STR基因座和12个X-STR基因座进行检测分型。以上检测均按照相关标准化操作规程手册进行。

1.2.2 STR分型

采用MJ Mini型扩增仪（美国BIO-RAD公司）进行PCR扩增，使用3130基因分析仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行毛细管电泳，运用Gene-Mapper®ID v3.2.1软件（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行基因型结果分析，实验过程参照标准化操作规程手册。

1.2.3 染色体核型分析

采集假定父外周血3 mL，肝素抗凝，取0.3 mL接种于外周血淋巴细胞培养基中，于37℃培养箱中培养72 h，加入终质量浓度为0.2 mg/mL的秋水仙素继续培养3 h后收获细胞。样本按照常规方法制片，镜下计数30个细胞，G显带分析5个中期分裂象。

1.2.4 Y染色体基因检测

使用2×Pfu PCR MasterMix（KP201）基因扩增试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］和C1000扩增仪（美国BIO-RAD公司）扩增Y染色体上SRY基因（上海生工合成，片段大小475 bp，SRY正向引物序列：5′-GAGGGCGGAGAAATGCAAGT-3′，反向引物序列：5′-TGTGCCTCCTGGAAGAATGG-3′），扩增后产物用2%琼脂糖凝胶电泳，Universal Hood II凝胶成像系统观察并拍照。提取的假定父血样DNA送广州金域公司检测AZF基因（包括sY82、sY84、sY86、sY124、sY127、sY128、sY133、sY134、sY143、sY145、sY152、sY239、sY242、sY254和sY255共15个位点）。

1.3 检验结果

1.3.1 常染色体STR基因座分型结果

假定父、假定母和女儿的20个常染色体STR基因座（D3S1358、D1S1656、D6S1043、D13S317、Penta E、D16S539、D18S51、D2S1338、CSF1PO、Penta D、TH01、vWA、D21S11、D7S820、D5S818、TPOX、D8S1179、D12S391、D19S433和FGA）和Amelogenin基因座进行分型检验，Amelogenin基因座的分型结果见图1。检验中发现假定父的Amelogenin基因只有X等位基因，等位基因Y未检出。

图1 Amelogenin基因分型结果

1.3.2 Y染色体和X染色体STR基因座分型结果

在假定父18个Y-STR基因座（DYS19、DYS385a/b、DYS389Ⅰ/Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS439、DYS438、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、Y GATA H4、DYS447、DYS448）的分型检测结果中观察到仅有4个基因座（DYS456、DYS458、DYS19及DYS393）有基因分型（图2）。假定父12个X-STR基因座（DXS7133、DXS8378、DXS981、DXS7424、DXS6789、DXS10159、GATA165B12、DXS101、DXS7423、GATA31E08、DXS10164、DXS10162）的分型结果显示12个X-STR基因座均有分型值，其中DXS7133和DXS7424基因座为纯合子，其他10个基因座为杂合子（图3）。此外，Amelogenin的分型检测结果观察到假定父的Amelogenin基因座的分型为XX（图3）。

图2 假定父Y18试剂盒的分型结果

图3 假定父X12试剂盒的分型结果

1.3.3 核型分析和Y染色体基因检测结果

假定父外周血淋巴细胞染色体核型镜下计数30个细胞，G显带分析5个中期分裂象，染色体核型分析为46，XX，inv（9）（p11q13）（图4）。在对假定父Y染色体基因检测时观察到假定父的SRY基因扩增结果与健康男性结果一致，含有475 bp大小的SRY基因扩增片段，而健康女性未扩增出相应的SRY条带，显示假定父SRY检测为阳性（图5）。而在对假定父进行的AZF基因检测结果显示其AZF基因的a、b和c三个区域均发生缺失。

图4 假定父染色体核型

图5 SRY基因电泳图

2 讨 论

本例在进行亲权鉴定中对一假定父20个常染色体STR基因座和Amelogenin基因进行STR分型检验时，发现其Amelogenin基因只有X等位基因，等位基因Y未检出，与假定父的社会性别不符。为进一步排除实验误差，我们进行了18个Y-STR基因座和12个X-STR基因座的分型检测。X染色体为人类性染色体，正常男性只有一条，来源于假定母，且每个X-STR基因座应只显示一个等位基因。正常女性有两条X染色体，每个X-STR基因座表现为杂合子或纯合子，来源父母各自一条染色体。本案检测结果发现：假定父18个Y-STR基因座仅检测到4个STR基因座有分型；而在12个X-STR基因座分型中，DXS7133和DXS7424基因座为纯合子，其他10个基因座为杂合子（图3）。推断假定父为46，XX男性。采集假定父的外周血进行染色体核型分析，结果为46，XX，inv（9）（p11q13），因此判定该假定父为46，XX性发育异常患者。

性发育异常疾病的临床分类较多，2006年欧洲儿科内分泌协会和Lawson Wilkins儿科内分泌协会提出将两性畸形和一些影响性发育的性染色体病，统称为性发育异常[1]（disorder of sex development，DSD）。46，XX DSD是一种非常少见的染色体畸变，且性发育异常，DELACHAPELLE等[2]于1964年首次报道，该病发生率在男性中为1/25 000～1/20 000，患者多为男性表型，但染色体核型为46，XX，此类患者社会性别多为男性特征，行为正常[3，4]。男性性别分化是一个由多基因调控的过程，人类SRY基因位于Yp11.32，该片段存在于Y染色体的男性特异区（male-specific region of the Y chromosome，MSY）。SRY基因在性腺向睾丸分化途径中具有起始分化的作用，性别决定是由SRY启动的多基因参与且相互作用的复杂过程，任何环节的异常均可导致性别的异常分化，SRY基因在性别分化中具有关键作用[5，6]。据报道[7，8]，90%以上的46，XX男性含有SRY基因，当SRY基因易位至X染色体或常染色体时，46，XX个体通常具有男性外生殖器；另外约10%的46，XX男性未检出SRY，外生殖器模糊，多伴有其他器官畸形，可能是某一参与性别决定、受SRY基因调控的靶基因发生突变导致向男性方向分化发育。我们检测到假定父SRY基因阳性，同大多数46，XX男性含有SRY基因一致，具有男性特征，行为正常[7]。但由于性别分化和发育的复杂性，该病在遗传与临床上仍有很大的异质性。

近十年，国内关于46，XX性发育异常的报道也逐渐增多，汇总情况见表1。大部分患者为SRY基因阳性，AZF检测正常，部分缺失和全缺失情况亦存在。Y染色体微缺失在男性不育的遗传因素中占据第二位，仅次于克氏综合征[9]。我们同时检测了Y染色体长臂远端控制精子发生的基因，即无精子因子（azoospermia factor，AZF），AZF区域划分为AZFa、AZFb和AZFc三个区。扩增覆盖AZF基因三个区域的15个位点，结果显示AZF基因的15个位点均未检测到条带，即AZF基因为全缺失，与欧阳洪根等[10-12]报道一致，该类患者高促性腺激素性性腺功能不全，睾酮水平较低，精液检查为无精症，提示假定父可能为无精子症患者。在邓国良等[13]报道的3例SRY阳性的46，XX男性性反转病例中，通过FISH方法检测到SRY基因是易位到X染色体上，这与国外报道[14-16]一致。此外，国外也有SRY基因易位到常染色体的报道[7]。在本案例中，假定父Y-STR基因分型结果显示在DYS456、DYS458、DYS19及DYS393基因座均有基因位点的存在，推测以上位点的DNA序列可能在SRY基因附近，和SRY基因连锁同时易位至X染色体或常染色体中。但具体的发病机制目前尚不明确，仍需要更多的分子遗传学证据来验证。另外，对46，XX性发育异常患者进行Y染色体微缺失检测，可对患者的生育能力进行明确的诊断[17]，避免了对患者造成医疗创伤，该检测简单快捷，可以被广泛应用。

表1 国内2007—2016年关于46，XX性发育异常患者报道的基因检测

近年来，随着亲权鉴定的不断增加，遇到假定父生物学性别与社会性别不一致的情况时，应引起从业人员的注意。首先确定检材是否正确，检查操作过程中人员、仪器和试剂等影响因素造成偏差的可能性；必要时重新取样，更换试剂盒排除相关因素，借助细胞学和分子遗传学技术对其进行进一步的检测，并提醒其接受一些相关的临床医学检查，以辅助其诊断疾病。在该病例中也反映出常染色体、性染色体STR的检测结果可以辅助临床医生进行诊断，具有重要的参考价值。

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DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.04.032

1004-5619（2017）04-0442-04

2016-07-11）

（本文编辑：张素华）

海南省自然科学基金资助项目（817379，20168312）；海口市重点科技计划资助项目（2011-0148）

张应爱（1979—），女，助理研究员，主要从事法医物证学及分子遗传学研究；E-mail：zhangyingai@hotmail.com