AML1/ETO阳性急性髓系白血病分子生物学特性的分析

梁楚嘉　李俊勋

[摘要] 目的 分析AML1/ETO阳性急性髓系白血病AML患者的分子生物学和临床特性，探讨治疗策略。方法 方便选取该院于2011年12月—2016年12月收治的55例AML1/ETO阳性的AML患者的临床特征、形态学、免疫学、以及治疗、生存情况进行分析总结。结果 55例AML1/ETO阳性的AML患者中，白细胞大于10×109/L的30例（55%），髓外浸润9例（16%）；14例表达CD19（25%），31例表达CD56（56%）；46例患者进行了诱导化疗，首次化疗CR率为71.7%，二次化疗CR率94.2%，6例死亡；55例骨髓片均有异常中性中幼粒细胞；骨髓中异常中性中幼粒细胞比例（30.567±17.33）%大于原始粒细胞，而外周血中则原始粒细胞比例（16.10±13.35）%高于异常中性中幼粒细胞比例。结论 AML1/ETO阳性AML患者易并发高危因素，明确影响预后的因素，对指导临床治疗和改善AML1/ETO阳性AML患者的生存有重要的意义。

[关键词] AML1/ETO阳性AML；形态学特征；预后因素

[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）07（a）-0016-04

Analysis of AML1/ETO Positive Acute Myeloid Leukemia Molecular Biological Characteristics

LIANG Chu-jia， LI Jun-xun

First Affiliated Hospital of Zhongshan University， Guangzhou， Guangdong Province， 510080 China

[Abstract] Objective To analyze the AML1/ETO positive acute myeloid leukemia molecular biological characteristics and study the treatment strategies. Methods Convenient selection 55 cases of AML patients with positive AML1/ETO admitted and treated in our hospital from December 2011 to December 2016 were selected and the clinical features， morphology and immunology， treatment and survival situations were analyzed and summarized. Results Of 55 cases， there were 30 cases whose leukocyte was more than 10×109/L （55%）， 9 cases with extramedullary infiltration （16%）， 14 cases with CD19 expression （25%） and 31 cases with CD56 expression （56%）， and 46 cases underwent the induced chemotherapy， and the first chemotherapy CR rate and second chemotherapy CR rate were respectively 71.7% and 94.2%， and 6 cases died， and there were abnormal neutrophilic granulocytes in 55 cases of bone marrow smears， and the ratio of abnormal neutrophilic granulocytes in bones was （30.567±17.33）%， which was bigger than that of myeloblast， and the ratio of myeloblast ratio in the peripheral blood was （16.10±13.35）%， which was higher than that of abnormal neutrophilic granulocytes. Conclusion The AML patients with positive AML1/ETO are easy to be complicated by high-risk factors， and we should clear the prognosis influence factors， and it is of important significance to guiding the clinical treatment and improving the survival situation of them.

[Key words] AML patients with positive AML1/ETO； Morphological characteristics； Prognosis factors

AML1/ETO陽性是AML常见的融合基因，AML-M2（FAB分型）在临床上最为常见，其发病原因主要是由于t（8；21）（q22；q22）累及8号染色体上的ETO基因和21号染色体上的AML1基因易位导致AML1/ETO病变发生[1]。文献普遍描述伴有AML1/ETO阳性的AML预后良好，但影响AML1/ETO预后的因素较多，除髓外侵犯、附加核型异常等因素影响外，临床通过研究发现，分子生物学异常也是导致该疾病发生的高危因素。该文方便选取中山一院在2011年12月—2016年12月期间收治的55例AML1/ETO阳性的AML患者为研究对象，并通过分析其临床特征，探究AML1/ETO阳性急性髓系白血病疾病的分子生物学和临床特性，并探讨治疗策略，现报道如下。endprint

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便选取中山一院初诊AML1/ETO阳性的AML患者共67例为研究对象，回顾性分析患者的临床资料，其中12例资料不全，余55例纳入统计。55例中男性37例，女性18例，年龄中位数31（3～77）岁。55例中按FAB分型49例为M2（89.1%），3例M5b（5.5%），M1，MDS，M4a各1例（1.8%）。

1.2 分析方法

1.2.1 形态染色体分析法 从患者骼前或髂后上棘抽取约0.2 mL骨髓液进行涂片制成样本（涂5～8张），并分析其细胞化学及形态学染色，然后采用抗凝管抽取1 mL肝素用于FISH融合基因檢查，1～2 mL用于流式分型。按FAB分类骨髓细胞形态， 细胞化学染色包括：过氧化物酶染色（P0X）、碱性磷酸酶（NAP）、特异性酯酶染色（CE）、非特异性酯酶染色（NAE）及氟化钠（NaF）抑制试验、丁酸萘酚酯酶染色（NBE）。

回顾分析每例病例骨髓片异常中性中幼粒和原始细胞比例（200个有核细胞）；分析100个异常中性中幼粒细胞，报告多核仁（大于3个），有空泡，粗颗粒（颗粒比比可见细颗粒大2～3倍），核折叠，有伪足及胞浆中含Auer小体的异常中性中幼粒细胞比例；报告外周血片原始粒细胞和异常中性中幼粒细胞比例。

1.2.2 免疫分型检测法 按照中山一院流式细胞室常规采用活细胞间接荧光标记称之为免疫分型检测法，细胞检测采用美国BD公司生产的6色流式细胞仪（机型为BD FACSCanto II）进行检测。

1.2.3 融合基因检测法 利用AML1/ETO探针（光谱绿色直接标记AML1，光谱橘红直接标记ETO）取患者肝素抗凝骨髓2～3 mL，并作离心处理，转速为2 500 r/min，持续8 min后加0.075MKCI溶液5～10 mL放置30 min；再取1 mL甲醇：冰乙酸-3∶1制成的固定液吹打混匀和离心1 800 r/min，同样持续8 min去上清液；最后取6 mL固定液去上清液，所有工序重复3次。将所得的液体进行涂片制成样本，并依次放入到浓度为70%、85%、100%乙醇或2XSCC（pH=7.0）中浸泡，2 min后取出样本并作脱水处理，再利用18×18盖玻片将样本封片并胶封，胶封后为使样本变性需将其放置在75°C的热台上烘烤，烘烤后再放入37°C培育箱进行培育杂交，培育过程一般为12 h，培育杂交完成后去除盖玻片，并将样本放入到72°C0.4Xssc/NP-40（pH=7.0）溶液中浸泡2 min，或放入浓度为0.05%的Tween-20溶液（pH=7.0）中浸泡30 s，最后取出晾干加盖玻片，放置在10 uL DAP lantifad的暗视野荧光显微镜观察细胞分子状态。

检测结果判断：杂交信号检查采用配有DAPI/TRITC/FITC三色激发块的O-lympusBX51荧光显微镜，照相采用Olympus PM30显微照相机进行，每个样本观察500个间期细胞。若荧光显微镜出现2橘红2绿色分散荧光信号则说明细胞间期正常，若出现2黄色1橘红1绿色信号则表明细胞呈AML1/ETO阳性。

1.2.4 随访 根据患者的门诊及住院病例资料对患者进行随访，随访日期从患者确诊之日起算，随访结束时间为2016年12月31日，若在此期间患者出现死亡，则随访结束时间为患者死亡日期。随访期间应详细记录患者的临床特征和改善情况。

1.3 统计方法

采用SPSS 19.0统计学软件分析所得数据。用 Kaplan-Meier方法分析患者生存期。采用 Cox回归法分析多因素并找出对患者总体生存生存期有显著影响的相关危险因素。

2 结果

2.1 临床特征

55例患者初诊时有37例表现为乏力、面色苍白等贫血症状，9例有基础疾病，4例为体检发现，5例有出血症状。30例WBC>10×109（55%），25例<10×109（45%），41例LDH升高（75%），18例AST升高（30%），17例ALT升高（30%）。出现发热症状28例，出现鼻牙龈皮肤黏膜等出血现象13例，3例患者出现肝脾淋巴结肿大，髓外浸润9例（16%），包括绿色肉瘤和中枢神经系统白血病的4例（7%），9例未化疗，化疗的46例中，首次化疗CR率为71.7%，二次化疗CR率94.2%，低于文献报道。6例死亡。

2.2 形态学特征

2.2.1 原始数据 55例患者中，有47例患者骨髓有Auer小体出现（85%），7例未发现Auer小体，该次统计中，除MDS外，其它类型白血病均有Ruer出现；异常中性中幼粒细胞在形态上可出现数量不等的粗颗粒，空泡和伪足，表现出典型的核幼质老现象。见表1。

2.2.2 形态学特性分析 所有AML1/ETO阳性急性髓系白血病中均可找到异常中性中幼粒细胞（1%～71%），AML1/ETO阳性率明显高于异常中性中幼粒细胞（表2）；AML1/ETO比例与含粗颗粒异常中性中幼粒比例之间差异有统计学意义（P=0.003），AML1/ETO融合基因百分比越高，含粗颗粒的异常中幼粒的比例越高；AML1/ETO比例与骨髓异常中性粒细胞比例呈正相关（r=0.79， P=0.015）；AML1/ETO的表达与年龄呈负相关（P=0.006）；外周血中，原始粒细胞比例大于异常中性中幼粒比例（P=0.002），而骨髓中异常中性中幼粒比例大于原始粒细胞比例，差异有统计学意义（P=0.026 8）；外周血PLT的量与HGB的量呈正相关（P=0.001）。

外周血原粒，HGB和PLT之间差异无统计学意义；骨髓中原始粒细胞比例、含粗颗粒中性中幼粒细胞比例、有伪足中性中幼粒比例、含空泡的中性中幼粒细胞比例之间无显著相关；AML1/ETO比例与上述各指标之间差异无统计学意义。endprint

2.3 免疫表型

2.3.1 免疫表型的表达 常见的免疫表型：55例表达CD117、MPO，53例表达CD34，50例表达CD33和CD13，31例表达CD56，14例表达CD19，34例表达CD15，10例共表达CD19，CD56。少见表型：2例表达CD10，3例表达CD22，1例表达CD71，4例表达CD7，1例表达CD64，1例表达CD79a，1例表达CD2，2例表达CD14。

2.3.2 免疫表型的相关性 CD15的表达与CD117，CD34，AML1/ETO的表达呈负相关（r=0.76、0.68、0.71，P=0.001、0.030、0.011），CD117与CD34，AML1/ETO的表达呈正相关（r=0.72、0.69，P=0.0001，0.001）；CD117的表達与骨髓中原始粒细胞比例的表达呈正相关（r=0.76，P=0.006）。

3 讨论

过去人们都认为急性髓系白血病呈AML1/ETO阳性说明患者预后良好[2-3]，但是随着医学技术的不断发展，临床检测技术有了明显提升，临床发现AML1/ETO阳性急性髓系白血病患者的生存周期和治愈率并不高，且其预后效果不理想，有学者[4]指出各种族具有不同的药物耐受性，且白血病细胞在不同种族之间存在生物学多样性的差异等因素有关。该文对55例患者的随访资料进行形态学特性分析，分析其生物学特性（包括中枢神经系统白血病、肝酶学、外周血白细胞计数、免疫表型、髓外白血病）、并采用统计学分析其治疗相关因素（获得完全缓解时间）等影响AML1/ETO阳性急性髓系白血病患者生存期的因素。研究显示AML1/ETO阳性急性髓系白血病患者具有一些特异性的形态学特征，其影响AML1/ETO阳性急性髓系白血病患者预后的因素[5]主要有①治疗前生物学特征， 如患者的初诊时中枢神经系统白血病、白细胞计数、免疫表型等；②治疗后的相关预后措施以及预后缓解所需的时间。

按FAB分型标准，按“明显的核浆发育不平衡， 核的发育落后于胞质， 胞质中易见空泡， 分化差者核的凹陷处有少许中性颗粒， 分化良好者胞质中充满中性颗粒，有核仁”，划人“异常中幼粒细胞”细胞形态[6]，该研究亦可见到不同程度的伪足，有85%的AML中出现不同程度的Ruer小体，表现出典型的核幼质老现象，结合该次有髓外免疫表型的出现，如淋系的CD2、CD7、CD19、CD10、CD79a等，这种核浆发育不平衡现象实际是胞核，胞质的多种蛋白形成紊乱造成的，如代表细胞发育阶段的蛋白形成紊乱：代表干/祖细胞的蛋白和代表较分化细胞的蛋白共存（CD34和CD33），代表T和B细胞共存（CD56和CD19），代表不同细胞系列的蛋白共存（CD33和CD19共存）等，同时在同一细胞出现的系列蛋白又不能共同表达，造成了这种蛋白紊乱的现象[7]，亦有文献认为[8-9]，AML1/ETO与这种蛋白紊乱的现象有联系。

该研究中发现在AML1/ETO阳性AML患者的骨髓片均可找到不同程度异常中幼粒细胞，而且AML1/ETO的表达与异常中性中幼粒细胞的量呈正相关，说明在AML1/ETO阳性AML中均可发现异常中性中幼粒细胞，但两者的阳性率不同，AML1/ETO阳性率明显高于异常中性中幼粒细胞，表明基因水平的异常比细胞水平出现的更早、更广泛。另外，该次研究发现患者年龄越小，AML1/ETO表达的量越大，这在文献中并无报道。研究发现，在AML1/ETO阳性AML患者的骨髓片中，异常中性中幼粒细胞比例大于原始粒细胞的比例，而在血片中，原始粒细胞的比例大于异常中性中幼粒细胞的比例的现象，这种现象在以往的文献报道中也并未发现。

获得完全缓解时间是利于预后的因素，55例患者中9例未化疗，化疗的46例中，首次化疗CR率为71.7%，二次化疗CR率94.2%，略低相关文献报道96.7%[10]，可能与这表明在接受诱导缓解治疗方案及种族间耐受性有关；多因素表明，获得完全缓解的时间越长，患者的生存期就越长，患者的长期生存率越高。

综上所述，AML1/ETO阳性AML形态学特征、临床特征、生物学特性需从伴融合基因进行分析，伴融合基因对患者的生存具有重要的影响，并且其为进行分析为AML的预后评估提供了新的依据，指导临床的治疗，使更多患者获得长期生存。

[参考文献]

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[3] 肖世极.Prognostic Significance of EVI1 Expression in Adult Acute Myeloid Leukemia Patients[D].福州：福建医科大学 ，2015.

[4] 肖湘. 难治/复发急性髓系白血病线粒体ATP合酶β亚单位（ATPsyn-β）水平的变化及与白血病耐药、预后关系的研究[D].长沙：中南大学，2013.

[5] 钟清秀. Studying the Biological Characteristics of Several AML Cell Lines and the Mechanism of Reversing Drug-resistance in Kasumi-1Cells：[D].深圳：南方医科大学，2015.

[6] 冯建华. 识别B系白血病细胞新单抗ZCH-2F10的制备、鉴定及其生物学特性和临床预后意义研究[D].杭州：浙江大学， 2013.

[7] 郝晓晓. The Establishment of Overexpression of CEBPα Combined with PU.1 in Jurkat Cell Line and the Exploration of Its Biology：[D].深圳：南方医科大学， 2015.

[8] 朱晓健.Biological Functions and Clinical Applications of BCR-ABL1-positive Microvesicles[D].武汉：华中科技大学， 2014.

[9] 刘筱姝.A Primary Clinical Study of Sorafenib Combined with Low Dose Cytarabine on FLT3～+ Relapsed and Refractory Acute Myeloid Leukemia[D].深圳：南方医科大学， 2016.

[10] 程玉萍.Study on the Biological Characteristics of a Novel Human Acute Myeloid Leukemia Stem Cell Marker3A4Antigen[D].杭州：浙江大学 ，2015.

（收稿日期：2017-04-07）endprint