河南沿黄稻区粳稻种质资源香味基因筛选

郭 凯， 宋宁垣， 孙红正， 赵全志

(河南农业大学农学院，河南 郑州 450002)

河南沿黄稻区粳稻种质资源香味基因筛选

郭 凯， 宋宁垣， 孙红正， 赵全志

(河南农业大学农学院，河南 郑州 450002)

利用水稻香味基因Badh2第2外显子和第7外显子特异的分子标记筛选了河南沿黄稻区208份粳稻种质资源，从中筛选出15份含有香味基因的种质材料，其中Badh2基因第2外显子突变类型12份，第7外显子突变类型3份。在河南沿黄稻区光周期条件下，这15份种质材料的开花日期从7月下旬至9月上旬不等，全生育期115 ～170 d。

水稻；香味基因；种质资源；分子标记

随着水稻产量的增加，提高稻米品质成为水稻育种工作的另一重大课题。香味是评价稻米食味品质的重要指标，优质香味稻米在国内外市场普遍受消费者青睐，具有较好的经济效益和市场前景，因此，香味水稻品种的选育一直受到育种者的重视。目前水稻中鉴定出来的可挥发性化学物质超过114种，其中与水稻香味直接相关的主要化学物质已经确定为2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)[1]。2AP是一种挥发性化合物，BRADBURY等[2-3]最先发现位于第8染色体的甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2第7外显子8 bp碱基缺失和3个碱基突变导致该基因功能缺失，进而导致2AP的积累。随后SHI等[4]在“苏玉糯”中发现第2个水稻香味等位基因，该香味基因是Badh2基因第2外显子发生了7 bp碱基缺失导致该基因功能缺失。GAO等[5]在“妙香糯”中发现了第3个香味等位基因，该等位基因是Badh2在第4和第5外显子之间发生了803 bp的碱基缺失。Badh2基因的产物BADH2催化γ-氨基丁酸醛的氧化，Badh2基因的功能缺失导致γ-氨基丁酸醛的积累，而γ-氨基丁酸醛是2AP合成的前体物质，因此,香稻中2AP的增加是由于其合成前体物质增加的结果[6]。在香味水稻品种育种中，对稻米香味的准确鉴定在育种选择过程中是十分关键的问题。传统的稻米香味鉴定方法包括咀嚼法和氢氧化钾浸泡法[7]。咀嚼法即在水稻收获以后咀嚼水稻谷粒判断是否有香味，氢氧化钾浸泡法是将新鲜叶片剪碎后用1.7%氢氧化钾溶液浸泡10 min后靠嗅觉判别是否有香味。传统评价香味方法简单易行，不需要特殊设备，但是对香味的判断主观性较强，不同的测试者可能得到不同的结果。分子标记技术是基于基因序列的标记技术，不受外界环境和主管评价等因素的影响，利用分子标记技术对香味基因进行分子标记辅助育种有利于提高选择的效率和准确性，目前已在水稻产量、品质、病虫害抗性等领域育种中得到应用并取得较好的效果[8]。河南沿黄稻区是闻名全国的优质粳米生产基地之一，得天独厚的黄河水灌溉条件，加上光照充足，灌浆期间昼夜温差大，非常有利于优质稻米的生产[9]。但是,目前推广的水稻主栽品种中，含有香味基因的水稻品种并不多。香味基因的导入需要含有香味基因的种质资源，利用杂交的方法导入到主栽品种中，从后代中选择含香味基因的单株。遗传研究表明，香味基因为单隐性质量性状，纯合香型单株在杂交分离后代中只占25%左右，传统选择鉴定的效率及准确性不高，借助分子标记辅助选择育种已在香稻育种中开始应用[10-12]。另外，在水稻杂交时父母本花期不遇也是香味基因导入主栽品种的主要障碍。水稻是短日照作物，不同纬度地区间引种栽培会引起生育期较大变化，能否将香味基因导入沿黄稻区主栽品种，取决于已知含有香味基因的水稻品种在当地条件下是否能够与主栽品种花期匹配。Badh2基因第2外显子和第7外显子缺失是比较常见的香味基因类型[12]。利用香味基因Badh2第2外显子和第7外显子特异的InDel标记对208份粳稻资源进行筛选，以期筛选出各个不同开花时期的含有香味基因的粳稻种质资源，以指导河南沿黄稻区香稻品种的分子标记辅助选育工作。

1 材料与方法

1.1材料

本研究中208份粳稻种质资源见表1。 所有水稻材料种植于河南农业大学科教园区内(113.42 E 34.44 N)，于2015-05-01播种育秧，2015-06-15插秧，生育期内进行常规大田管理，对所有材料于开花日期进行记录。

1.2香味基因检测方法

采用SDS(十二烷基硫酸钠)方法提取水稻叶片全基因组DNA，并稀释至50 mg·L-1。根据Badh2基因序列分别扩增包含第2外显子和第7外显子片段，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测水稻Badh2基因片段PCR扩增产物长度，根据PCR产物长度判断该位点是否存在InDel缺失，进而判断该基因是否是香味基因以及是哪一种香味基因突变类型。其中，检测第2外显子突变类型的引物为E2-F(GGGAGGCGCTGAAGAGGA)，E2-R(GGGTAGTCACCACCCTACCTTG)[13]，检测第7外显子突变类型的引物为E7-F(TTAGGTTCTGAAGCCGGTGC)，E7-R(TCCACAGAAATTTGGAAACAAACCT)。PCR反应为20 μL，其中DNA模板为1.0 μL，2×PCR mix为10.0 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL、水为7.0 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR反应结束后，采用6%聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳，电泳后银染观察并记录结果。

2 结果与分析

2.1不同水稻种质资源的开花期

本研究中共收集粳稻材料208份种质资源。这些种质资源在河南沿黄稻区生态条件下的开花日期从7月中旬至9月上旬不等。根据其开花时期将208份粳稻材料分为5大类：7月中旬开花的材料11份，其中安农晚粳B、生态稻、卫国3份材料开花最早，7月12日前后进入开花期；7月下旬开花的材料14份；8月上旬开花的材料30份；8月中旬开花材料46份，8月下旬开花材料90份；9月上旬开花材料17份(表1)。同种材料不同纬度种植其生育期会发生一定变化，不同地方引种时应考虑其生育期长短。在杂交育种中，父母本花期能否相遇是育种工作的重要前提。

2.2香味基因分子标记的特异性

本研究所用2个分子标记E2, E7分别检测Badh2香味基因第2外显子和第7外显子碱基缺失，其中分子标记E2在香味基因与非香味基因上分别能扩出100和107 bp的片段，分子标记E7在香味基因与非香味基因上分别能扩出215 和223 bp片段(表2)。PCR片段经过6%PAGE胶电泳、显色，胶图上显示相应的DNA片段，香稻与非香稻之间条带差异明显、易分辨，而且标记呈共显性，能分辨出纯合香味基因、纯合非香味基因以及香与非香杂合基因位点(图1B)。

表1 208个水稻材料在河南沿黄稻区光照周期条件下的开花时期Table 1 The flowering time of 208 rice materials under photoperiod condition alongside Huanghe River in Henan

表2 2个香味类型分子标记信息Table 2 Information of two types of fragrance gene markers

2.3种质资源的香味基因检测结果

分别以208份粳稻材料的DNA为模板，以分子标记E2进行PCR扩增，电泳结果表明，208份材料中有武香粳9号、宁粳2号、白香粳、宁粳3号、武育粳21、南粳5055、武香粳14、银香1号、南粳46、南粳9108、新稻568、小香共12份材料可扩增出100 bp大小片段，说明武香粳9号等12份材料属于同E2外显子突变类型香稻材料，在Badh2基因第2外显子存在7 bp缺失。日本晴等其他材料扩增出107 bp大小片段，表明这些材料的Badh2等位基因不存在7 bp缺失，属于非香类型。

以分子标记E7进行的检测表明，208份材料中云氮3号、高株稻、南粳52共3份材料可扩增出215 bp片段，日本晴等其他材料扩增出223 bp大小片段，表明云氮3号和高株稻属于第7外显子存在8 bp,缺失3 bp突变类型，其中南粳52可扩增出215 和223 bp两个片段，显示南粳52在Badh2基因位点是香与非香等位基因的杂合体。

3 结论与讨论

香味是评价稻米食味品质的重要指标，优质香稻品种选育也越来越受到水稻育种者重视，水稻杂交育种过程中花期不遇是杂交的主要障碍之一。在香稻品种选育过程中，选择花期合适的香味基因供体亲本是选择香稻品种的前体和基础。本研究中筛选了208份水稻粳稻资源，在河南沿黄稻区生态条件下开花期从7月中旬到9月上旬不等，从中筛选出含有香味基因的水稻品种/品系15份，其中第2外显子突变类型12份，第7外显子突变类型3份，这些含有香味基因的水稻材料开花期从7月旬至9月上旬不等。不同花期的水稻品种如果要杂交导入香味基因均可找到可匹配的香稻材料，这为沿黄稻区香稻杂交选育提供了可供选择的基因来源。另外，在杂交后代选择过程中，香味的鉴定易受生态环境、栽培措施、主观因素等条件的影响，而且香味基因又是隐性等位基因，所以传统选择容易造成香味基因的丢失，而分子标记辅助选择不受环境和人为因素影响，能准确地判断香味基因的有无[8, 14]。可依据第2外显子突变类型和第7外显子突变类型特异的分子标记进行标记辅助选择以提高选择效率，为河南沿黄稻区优质稻米品种选育提供理论指导和技术支持。

A.分子标记E2检测的Badh2基因位点带型。1～12分别代表武香粳9号、日本晴、宁粳2号、方欣4号、白香粳、黄金晴、新丰2号、小香、方欣1号、南粳9108、新稻568、镇稻10号；B. 分子标记E7检测的Badh2基因位点带型。1～7分别代表云氮3号、日本晴、黄金晴、高株稻、方欣4号、新丰2号、南粳52。

A. Band genotype of E2 molecular marker. 1～12 indicates Wu-xiangjing 9, Nipponbare, Ningjing 2, Fangxin 4, Baixiangjing, Huangjinqing, Xinfeng 2, Xiaoxiang, Fangxin1, Nanjing 9108, Xindao 568, Zhendao 10. B. Band genotype of E7 molecular marker. 1～7 indicates Yundan 3, Nipponbare, Huangjinqing, Gaozhudao, Fangxin 4, Xinfeng 2, Nanjing 52.

图12个分子标记对部分材料电泳检测图
Fig.1Electrophoresispatternof2molecularmarkersondetectedmaterials

[1] CHEN S, YANG Y, SHI W, et al.Badh2, encoding betaine aldehyde dehydrogenase, inhibits the biosynthesis of 2-acetyl-1-pyrroline, a major component in rice

fragrance[J]. Plant Cell, 2008, 20(7):1850-1861.

[2] BRADBURY L M, FITZGERALD T L, HENRY R J, et al. The gene for fragrance in rice[J]. Plant Biotechnology Journal, 2005, 3: 363-370.

[3] BRADBURY L M T, GILLIES S A, BRUSHETT D J, et al. Inactivation of an aminoaldehyde dehydrogenase is responsible for fragrance in rice[J].Plant Molecular Biology, 2008, 68(4):439-449.

[4] SHI W, YANG Y, CHEN S, et al. Discovery of a new fragrance allele and the development of functional markers for the breeding of fragrant rice varieties[J]. Molecular Breeding, 2008,22(2):185-192.

[5] SHAO G N, TANG A, TANG S Q, et al. A new deletion mutation of fragrant gene and the development of three molecular markers for fragrance in rice[J]. Plant Breeding, 2008, 130(2):172-176.

[6] KOVACH M J, CALINGACION M N, FITZGERALD M A, et al. The origin and evolution of fragrance in rice (OryzasativaL.)[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009 ,106(34):14444-14449.

[7] 杨扬，谢震泽，王轲，等. 水稻香味的遗传研究进展[J].首都师范大学学报(自然科学版), 2010, 31(3)：24-29:.

[8] 朱义旺，林雅容，陈亮. 我国水稻分子育种研究进展[J].厦门大学学报(自然科学版), 2016, 55 (5):661-671.

[9] 王留梅.河南沿黄稻区优质稻米产业现状与发展对策[J]. 中国稻米, 2006, 12(5):56-57.

[10] 许言福，黄菊，王英存，等. 两种筛选水稻badh2-E2类型香味基因分子标记的建立[J].分子植物育种, 2015(11):2441-2445.

[11] 张江丽，李苏洁，李娟，等. 不同来源水稻种质资源香味基因badh2位点的鉴定[J].分子植物育种, 2015, 13(4):727-733.

[12] 闫影，诸光明，张丽霞，等. 水稻香味基因分子标记的开发及应用[J].西北植物学报, 2015, 35(2):269-274.

[13] 王军，杨杰，陈志德，等. 水稻香米基因标记的开发与应用[J]. 分子植物育种, 2008, 6(6):1209-1212.

[14] 魏文嵩，胡纯仰，乡少芹，等. 特种稻红米与香味分子标记多重PCR体系的构建与应用[J].分子植物育种, 2015, 13(5):977-981.

(责任编辑：常思敏)

ScreenofricegermplasmwithfragrancegeneinregionsalongsideHuangheRiveofHenan

GUO Kai, SONG Ningyuan, SUN Hongzheng, ZHAO Quanzhi

(College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Two hundred and eight rice germplasms from regions alongside the Huanghe River in Henan province were screened and 15 were found containing the fragrance geneBadh2. Of the 15 fragrance rice germplasms, 12 were exon 2 mutant type and 3 were exon 7 mutant type. Under photo-period condition alongside Huanghe River in Henan, the flowering time of the 15 fragrance rice germplasms va-ried from late in July to early in September.

rice; fragrance gene; germplasm; molecular marker

S 511.1

：A

2016-12-20

河南省重大科技专项(141100110600)

郭 凯(1991-)，男，河南安阳人，硕士研究生，从事稻米品质研究。

赵全志(1968-)，男，河南驻马店人，教授，博士。

1000-2340(2017)03-0308-04