梓醇对AGEs刺激肾系膜细胞介导巨噬细胞极化的影响

2017-09-23 03:25富莹雪陈玉萍卞文青许惠琴戴国英沈红胜甘啸阳
中国药理学通报 2017年10期
关键词:系膜小室孔板

富莹雪,陈玉萍,卞文青,许惠琴,戴国英,沈红胜,甘啸阳,王 威

(1.南京中医药大学药学院,2.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏 南京 210023)

梓醇对AGEs刺激肾系膜细胞介导巨噬细胞极化的影响

富莹雪1,2,陈玉萍1,2,卞文青1,2,许惠琴1,2,戴国英1,2,沈红胜1,2,甘啸阳1,2,王 威1,2

(1.南京中医药大学药学院,2.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏 南京 210023)

目的探讨梓醇对晚期糖基化终末产物(AGEs)刺激肾系膜细胞介导巨噬细胞极化的影响。方法将巨噬细胞(RAW264.7)置于Transwell上层小室,肾系膜细胞(MMCs)于下层孔板进行体外共培养,设置模型组、0-BSA对照组、梓醇组(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1),另设氨基胍组(1.0 μmol·L-1)作为阳性对照。加入各药物预孵下层系膜细胞1 h后,用AGEs(100 mg·L-1)刺激,继续孵育23 h,采用ELISA法检测系膜细胞上清液中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的分泌水平; Western blot法检测巨噬细胞 M1 型标记蛋白iNOS、CD16/32、TNF-α、COX-2和M2 型标记蛋白CD206、Arg-1的表达水平;流式细胞仪检测巨噬细胞iNOS与CD206蛋白表达百分率。结果AGEs可提高系膜细胞MCP-1的分泌水平(P<0.01),上调巨噬细胞iNOS、TNF-α、CD16/32、COX-2蛋白表达(P<0.05,P<0.01),下调CD206和Arg-1蛋白表达;而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)预孵能降低系膜细胞MCP-1的分泌水平(P<0.01),下调iNOS、TNF-α、CD16/32、COX-2蛋白表达(P<0.05,P<0.01),上调CD206和Arg-1蛋白表达(P<0.05),并呈浓度依赖性。结论梓醇可通过调控AGEs刺激系膜细胞分泌MCP-1的水平,抑制巨噬细胞的M1型极化,并促进其向 M2 型极化,减轻炎症反应,缓解糖尿病肾损伤。

梓醇;晚期糖基化产物;系膜细胞;单核趋化蛋白-1;巨噬细胞;极化;糖尿病肾病

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见且最难治的微血管并发症,其特征主要表现为炎症、系膜基质累积以及肾小管间质纤维化[1]。晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)在DN的发生发展中起到重要的作用[2-4]。近年来研究发现,AGEs还可加重DN炎性损伤[5-7]。巨噬细胞作为主要的炎性细胞,通过其两种极化表型参与炎症反应及维持内环境稳态:即经典活化的 M1型巨噬细胞,具有促进炎症、介导损伤的功能;替代活化的M2型巨噬细胞,具有抑制炎症、促进损伤组织修复和重建的功能[8-9]。越来越多的证据表明,巨噬细胞和肾脏固有细胞共同参与DN的发展[10-16]。肾脏固有细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-Ⅰ)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule Ⅰ, ICAM-1)等,使巨噬细胞向M1型极化[9,16],参与炎症反应,加重糖尿病肾损伤[9-11,17]。

梓醇是生地黄的主要效应成分,具有较好的抗炎和保护肾脏等药理作用[18]。研究证实,梓醇能减少巨噬细胞募集,抑制炎症反应[19],并可抑制肾皮质转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)和血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)的表达,减少细胞外基质积聚,改善DN[20]。鉴于以上认识,本实验从DN病机出发,建立用AGEs刺激的系膜细胞与巨噬细胞共培养模型,观察和探讨梓醇对巨噬细胞极化的干预作用,为其减轻由巨噬细胞参与的糖尿病肾损伤提供实验依据。

1 材料

1.1细胞与试剂小鼠肾系膜细胞(mouse mesangial cells, MMCs),购自中国科学院上海细胞库;小鼠巨噬细胞(RAW264.7)由南京中医药大学药理学实验室惠赠。梓醇(catalpol)标准品(HPLC≥98%),购自成都瑞芬思生物科技有限公司,批号:Z-005-160502;氨基胍(aminoguanidine),Sigma公司进口分装;DMEM/F-12 1 ∶1(1×)培养液、质量浓度为1.5 g·L-1的胰蛋白酶,美国Gibco公司;胎牛血清,美国Gemini公司;二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT),美国Sigma公司;RIPA裂解液,碧云天生物技术研究所;MCP-1 ELISA试剂盒,上海酶联生物科技有限公司,批号:201703;iNOS、TNF-α、COX-2、CD206、Arg-1抗体,英国Abcam公司;CD16/32抗体,美国Affinity公司。

1.2仪器Synergy HT酶标仪,美国Bio-Tek公司;二氧化碳培养箱,日本SANYO公司;FACS Calibur流式细胞仪,美国BD公司;垂直凝胶电泳仪,美国伯乐公司;凝胶成像系统,美国GE公司;Transwell 3450、3413共培养板,美国Corning公司。

2 方法

2.1AGEs的制备将 0.5 mol·L-1葡萄糖与 50 g·L-1的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)充分溶解于磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4),37℃避光孵育4个月,形成 AGEs-BSA。与此同时,在平行条件下配制不含葡萄糖的上述 BSA 溶液,使其形成 0-BSA 溶液(无糖基化BSA)作为对照。AGEs 形成后,用孔径为分子量1万的透析袋于10 mmol·L-1PBS缓冲液中4℃透析24 h,除去未反应的葡萄糖,后经0.22 μm微孔滤器过滤,除去细菌,经BCA蛋白定量测得浓度为16 g·L-1。

2.2细胞培养小鼠肾系膜细胞(MMCs)和小鼠巨噬细胞(RAW264.7)用含1 g·L-1胎牛血清及0.1 g·L-1青霉素-链霉素溶液的DMEM/F12培养基培养,取对数生长期细胞用于实验。

2.3ELISA法检测系膜细胞上清液MCP-1的分泌取对数生长期MMCs调整至1×108·L-1,每孔1 mL接种于24孔板内,另取对数生长期RAW264.7以5×107·L-1,每孔0.5 mL接种于0.4 μm的Transwell小室,置于孵育箱中贴壁融合后,24孔板和Transwell 小室分别更换为不含FBS的DMEM培养基饥饿培养24 h。将细胞分为模型组、梓醇(终浓度分别为0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)组、氨基胍(终浓度为1 μmol·L-1)组,每组设4个复孔,预孵24孔板内的MMCs 1 h后,用终浓度为100 mg·L-1的AGEs刺激,而空白对照组用100 mg·L-1BSA代替,最后将Transwell小室移至接种MMCs的24孔板上方共培养。23 h后,提取下层6孔板内MMCs上清液,按ELISA试剂盒操作说明书,检测细胞上清中MCP-1水平。

2.4流式细胞仪检测巨噬细胞蛋白表达百分率取对数生长期MMCs调整至5×108·L-1,每孔2 mL接种于6孔板内,另取对数生长期RAW264.7以3×108·L-1,每孔1 mL接种于0.4 μm的transwell 小室。分组与加药处理同“2.3”项,去除上层小室内培养液,用冰PBS冲洗3次RAW264.7,并吹打混悬于小室中,离心收集细胞,重悬在100 μL 1×Buffer缓冲液中,每管加1 μL一抗,在同型对照管中加入100 μL缓冲液,4℃冰箱中孵育20 min,每管中加2 mL 1×Buffer缓冲液,4℃ 300 r·min-1离心5 min,并弃去上清。用冰PBS冲洗3次,将细胞重悬在100 μL 1×Buffer 缓冲液中,加入0.8 μL荧光标记二抗,4℃冰箱中避光孵育20 min。用冰PBS冲洗3次后,移至流式测试管,500 μL 缓冲液重悬细胞,上机检测巨噬细胞中表达iNOS、CD206蛋白的百分率。

2.5Westernblot法检测巨噬细胞相关蛋白表达取对数生长期MMCs调整至2×108·L-1,每孔2 mL接种于6孔板内,另取对数生长期RAW264.7以1×108·L-1,每孔1 mL接种于0.4 μm的transwell 小室。分组与加药处理同“2.3”项。每组设3个复孔,吸除上层小室内培养液,用冰PBS冲洗RAW264.7并吹打混悬于小室中,离心收集细胞,用RIPA 裂解液提取细胞总蛋白,并测定蛋白浓度。蛋白样品加入1/5体积的5×蛋白上样缓冲液,95℃煮5 min,进行SDS-PAGE凝胶电泳,接着转印至 PVDF膜上,按约0.1 mL·cm-1量加入0.5 g·L-1封闭液,室温封闭2 h,一抗4℃过夜。次日PBST漂洗3次,加入辣根过氧化酶标记的二抗,室温孵育2 h,ECL显色。利用Image J软件分析各组灰度值,以β-actin为内参,计算iNOS、TNF-α、CD16/32、COX-2、CD206和Arg-1蛋白的变化。

3 结果

3.1梓醇对系膜细胞分泌MCP-1的影响与对照组比较,AGEs可明显提高系膜细胞MCP-1的分泌水平(P<0.01);而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)、氨基胍(1 μmol·L-1)可不同程度抑制其分泌(P<0.01),且梓醇的抑制程度与浓度相关(Tab 1)。

Tab 1 Effect of catalpol on level of MCP-1in MMCs induced by AGEs(±s,n=4)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

3.2流式细胞仪检测结果双变量流式细胞散点图显示,与对照组(Fig 1A、2A)相比,模型组(100 mg·L-1AGEs)表达iNOS蛋白的巨噬细胞比例升高(Fig 1B),表达CD206蛋白的巨噬细胞比例降低(Fig 2B);而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)和氨基胍(1 μmol·L-1)则不同程度下调iNOS的表达(Fig 1C~1F),上调CD206的表达(Fig 2C~2F)。

Fig 1 Effect of catalpol on expression of F4/80-iNOS inRAW264.7 macrophages mediated by AGEs-stimulated MMCs

A: Control(100 mg·L-10-BSA); B: Model(100mg·L-1AGEs); C: Catalpol(0.1 mol·L-1+AGEs);D:Catalpol(1.0 mol·L-1+AGEs);E:Catalpol(10.0 mol·L-1+AGEs);F:Aminoguanidine(1.0 mol·L-1+AGEs)

3.3梓醇对巨噬细胞M1型极化相关蛋白的影响与对照组比较,AGEs可明显上调系膜细胞介导的巨噬细胞iNOS(Fig 3)、CD16/32(Fig 4)、TNF-α(Fig 5)、COX-2(Fig 6)蛋白表达(P<0.05,P<0.01),而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)、氨基胍(1 μmol·L-1)可不同程度下调其表达(P<0.05,P<0.01),且梓醇的抑制程度与浓度相关,其中10.0 μmol·L-1的梓醇抑制作用最强(P<0.05,P<0.01)。

3.4梓醇对巨噬细胞M2型极化相关蛋白表达的影响与对照组比较,AGEs可明显下调系膜细胞介导的巨噬细胞CD206(Fig 7)和Arg-1(Fig 8)蛋白表达(P<0.05);而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)、氨基胍(1 μmol·L-1)可不同程度上调其表达(P<0.05),且梓醇对CD206、Arg-1表达的促进作用与浓度相关。

Fig 2 Effect of catalpol on expression of F4/80-CD206in RAW264.7 macrophages mediated by AGEs-stimulated MMCs

A: Control(100 mg·L-10-BSA); B: Model(100 mg·L-1AGEs); C: Catalpol(0.1 mol·L-1+AGEs); D: Catalpol(1.0 mol·L-1+AGEs); E: Catalpol(10.0 mol·L-1+AGEs); F:Aminoguanidine(1.0 mol·L-1+AGEs)

4 讨论

DN是一种常见的继发性肾病,巨噬细胞介导的炎症反应是DN发展的关键因素[21]。趋化因子MCP-1是肾脏炎症与肾损伤的主要启动子[22]。研究报道[16],AGEs可作用于肾脏固有细胞上的RAGE受体,促使MCP-1分泌,进而诱导、激活巨噬细胞。活化的巨噬细胞进一步分泌和释放肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)等[5,9,23],参与炎症反应,进而导致系膜增生,足细胞完整性改变,血管内皮细胞泡沫化,最终引起肾小球硬化等肾损伤[10,12-14]。因此,肾脏固有细胞、巨噬细胞及各种炎症分子交互调控,形成复杂的相互作用网络,值得人们关注。

Fig 3 Effect of catalpol on expressionof iNOS in RAW264.7 macrophages mediated byAGEs-stimulated MMCs(±s, n=3)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Fig 4 Effect of catalpol on expressionof CD16/32 in RAW264.7 macrophages mediated byAGEs-stimulated MMCs(±s,n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

随着对巨噬细胞的深入研究,认为它不仅介导肾组织炎性损伤,同时还参与肾组织损伤后的修复与重建[24-25]。在肾脏早期炎症阶段,巨噬细胞高表达iNOS和CD16/32(FcγRIII/II),呈M1表型,而在肾组织修复阶段,巨噬细胞高表达精氨酸-1(arginine-1, Arg-1)和甘露醇受体(mannose receptor, MR),呈M2表型[15]。另有研究表明[25],小鼠单侧输尿管结扎术后10 d解除梗阻,肾脏纤维化程度的减轻与巨噬细胞M2型标记物CD206(MR)相关。因而,巨噬细胞的不同活化状态决定肾脏疾病的发展方向[12-15]。

Fig 5 Effect of catalpol on expression ofTNF-α in RAW264.7 macrophages mediated byAGEs-stimulated MMCs(±s,n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

Fig 6 Effect of catalpol on expressionof COX-2 in RAW264.7 macrophages mediated byAGEs-stimulated MMCs(±s,n=3)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

本实验构建了肾系膜细胞与巨噬细胞共培养模型,经AGEs刺激肾系膜细胞后,其MCP-1分泌水平提高,同时伴随巨噬细胞M1型标记蛋白iNOS、TNF-α、CD16/32的表达水平提高,M2型标记蛋白CD206和Arg-1的表达水平降低,而使用梓醇预孵再经AGEs刺激可逆转上述效应,提示梓醇可能通过减少系膜细胞分泌MCP-1,抑制巨噬细胞向M1型极化,促使其向M2型极化,但具体机制有待进一步深入研究。

Fig 7 Effect of catalpol on expressionof CD206 in RAW264.7 macrophagesmediated by AGEs-stimulated MMCs(±s,n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

Fig 8 Effect of catalpol on expressionof Arg-1 in RAW264.7 macrophages mediatedby AGEs-stimulated MMCs(±s,n=3)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

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EffectofcatalpolonRAW264.7macrophagepolarizationmediatedbyAGEs-stimulatedmousemesangialcells

FU Ying-xue1,2, CHEN Yu-ping1,2, BIAN Wen-qing1,2, XU Hui-qin1,2,DAI Guo-ying1,2, SHEN Hong-sheng1,2, GAN Xiao-yang1,2, WANG Wei1,2

(1.CollegeofPharmacy,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210023,China;2.JiangsuKeyLabforPharmacologyandSafetyEvaluationofChineseMateriaMedica,Nanjing210023,China)

AimTo investigate the effect that catalpol intervenes macrophage polarization mediated by mouse mesangial cells(MMCs) stimulated by advanced glycation end products(AGEs).MethodsRAW264.7 macrophages and MMCs were co-cultured in vitro and divided into model group(100 mg·L-1AGEs), control group(100 mg·L-1BSA), catalpol(0.1, 1.0, 10.0 μmol·L-1) group, and aminoguanidine(1.0 μmol·L-1) group which was set as positive control. After being incubated with catalpol for 1 h, MMCs were stimulated by AGEs for 23 h. The proliferation-inhibition rate of MMCs was measured by MTT assay. MCP-1 in supernatant liquid of MMCs was detected by ELISA method. The expression of iNOS, CD16/32, TNF-α, COX-2, CD206 and Arg-1 was detected by Western blot. Simultaneously, the percentage of iNOS and CD206 was also measured by flow cytometry.ResultsAGEs could increase the level of MCP-1 secreted by MMCs. The expression of iNOS, TNF-α, CD16/32 and COX-2 protein of macrophage was up-regulated after MMCs stimulated by AGEs, while the expression of CD206 and Arg-1 was down-regulated. After being intervened by catalpol, these effects could be reversed. All the changes were concentration-related.ConclusionsCatalpol can inhibit macrophages M1-type polarization process and promote M2-type polarization, which may be mediated through MCP-1 secreted by MMCs after AGEs stimulation. Catalpol can ameliorate inflammation and relieve diabetic kidney injury.

catalpol; advanced glycosylation products; mesangial cells; monocyte chemotactic protein-1; macrophage; polarization; diabetic nephropathy

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.014

A

:1001-1978(2017)10-1399-05

R-332;R284.1;R322.61;R329.24;R587.2;R692.39;R977.6

时间:2017-9-5 9:26 网络出版地址:http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.028.html

2017-06-01,

2017-07-05

国家自然科学基金资助项目(No 81374029, 81073111);江苏省中药学优势学科开放课题(No JKLPSE201604)

富莹雪(1993-),女,硕士生,研究方向:内分泌药理学,E-mail: 449743578@163.com; 许惠琴(1961-),女,博士,教授,博士生导师,研究方向:内分泌药理学,通讯作者,E-mail:hqxu309@sina.com

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