基于载体减毒单增李斯特菌的弧菌疫苗菌株构建①

丁承超 陈国薇 谢曼曼 郭 亮 李 杰 孙静娟 刘 箐

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093)

·基础免疫学·

基于载体减毒单增李斯特菌的弧菌疫苗菌株构建①

丁承超 陈国薇 谢曼曼 郭 亮 李 杰 孙静娟 刘 箐

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093)

目的：利用减毒单增李斯特菌作为疫苗载体的优势，拟构建基于载体减毒单增李斯特菌的弧菌疫苗菌株。方法：使用单增李斯特菌表达载体pERL3过表达弧菌中共同的靶标抗原Ompk；利用PCR和RT-PCR技术分别对过表达菌株鉴定和抗原基因的检测。结果：PCR结果显示成功构建3株Ompk过表达菌株Lm-Ompk(L-O)、Lm-Lmo0576-Ompk(L-L-O)和Lm-P-Ompk(L-P-O)；测序结果显示过表达菌株中外源基因的序列与NCBI 结果相似性为100%；RT-PCR结果显示Ompk基因在3株过表达菌株中的转录水平均极为显著(P<0.001)；在抗生素条件下，Ompk基因在各过表达菌株中的表达水平显著高于在非抗性条件下的转录水平(P<0.05)。结论：成功构建了3株基于载体减毒单增李斯特菌的弧菌疫苗菌株，弧菌中共同的靶标抗原Ompk在3株重组菌株中均可以稳定表达。

减毒单增李斯特菌；疫苗载体；弧菌疫苗；Ompk；抗原基因

单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocy-togenes,Lm)是一种革兰阳性兼性厌氧胞内寄生条件致病菌。该菌可穿越肠道屏障、血脑屏障和胎盘屏障，引起人和动物的胃肠炎、脑膜炎、败血症[1,2]。Lm具有典型的胞内寄生和胞间传递等特性，减毒后作为疫苗载体，能够同时将外源性抗原表位加载于MHCⅠ和MHCⅡ抗原递呈系统，刺激机体产生强烈的细胞免疫应答[3,4]。目前，actA/plcB、hly、prfA、actA等单个或者多个毒力基因敲除减毒Lm已应用于肿瘤、病毒等DNA疫苗载体中，部分疫苗已经进入Ⅰ期、Ⅱ期临床实验[5,6]。因此Lm已成为最重要的减毒活载体疫苗载体之一。另外，目前并未发现Lm的胞内寄生和其致病性的必然关系，比如目前关于其致病性报道最多的是其可随食品传染人类并导致严重的疾病，甚至死亡，但对其原始宿主，如牛、猪、羊等畜类，并未发现其严重的致病性，这为其作为除人类之外的动物减毒疫苗载体提供了可能性。尽管减毒Lm作为疫苗载体已经成功应用于哺乳动物，但其作为水产疫苗载体的潜力同样值得关注。Lm对环境耐受性强，可在较高的盐浓度以及宽泛的pH(3～12)和温度范围(0～45℃)内生长，这种超强的环境适应能力拓宽了Lm在水产领域的使用范围。

弧菌不仅是水生动物细菌性疾病的最重要的病原菌之一，而且部分弧菌如副溶血性弧菌还是重要的食源性致病菌[7]。抗生素是水产养殖中防治弧菌病的最主要手段，但随着抗生素滥用导致细菌抗药性、抗生素残留、水体污染等问题日益突出，寻求新的弧菌控制方法已成产业、学术界的共识。疫苗是控制弧菌的最佳选择。外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)位于革兰阴性菌表面，呈β-桶状结构，其具有良好的免疫原性，不仅可激发机体体液免疫和细胞免疫，而且在不同弧菌及血清型菌株之间具有良好的免疫交叉保护作用，因而被国内外公认为是一种潜在的共同保护性抗原[8-10]。Ompk (Outer membrane protein K)蛋白广泛存在于不同血清型的副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)中，而且与其他弧菌中的Ompk蛋白高度同源，是弧菌疫苗中一种潜在的共同抗原[11-13]。

本文利用减毒Lm作为疫苗载体的优势，使用Lm表达载体pERL3过表达弧菌中共同的靶标抗原Ompk，拟构建基于载体减毒Lm的弧菌疫苗菌株。其中Lm-Ompk(L-O)为单纯过表达Ompk基因的疫苗候选菌株；Lm-Lmo0576-Ompk(L-L-O)利用Lmo0576基因具有很好的分泌和锚定外源蛋白的功能过表达Ompk基因的疫苗候选菌株[14]；Lm-P-Ompk(L-P-O)为带Ompk基因启动子的疫苗候选菌株。基于载体减毒Lm的弧菌疫苗株的构建及抗原基因的表达和检测，为水生动物弧菌病的防治提供了新思路。而且，本文所构建的重组活载体疫苗株不仅可以注射接种，减毒Lm作为疫苗载体同样可以采用口服、浸泡等其他非注射接种方式。从经济角度出发，非注射接种方式在水产疫苗领域是一种更为理想的疫苗给药方式。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂和菌株 限制性内切酶、DNA高保真聚合酶、dNTPs、DNA 分子标记、T4 DNA 连接酶、反转录试剂盒和SYBR Green试剂盒均购自大连宝生物公司；实验引物由上海生工生物有限公司合成；脑心浸出液(Brain heart infusion,BHI) 培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；红霉素购自上海朝瑞生物科技有限公司；细菌基因组抽提试剂盒、核酸凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自天根生化科技 (北京) 有限公司。 PCR仪、凝胶成像仪，香港Gene Company Limited 基因有限公司；MicroPulser电穿孔仪，美国Bio-Rad公司；SpectraMax M2酶标仪，美国Molecular Devices公司；实时荧光定量PCR仪，美国Applied Biosystems公司；双基因缺失减毒单增李斯特菌EGDe-ΔactA/ΔinlB由丁承超等[15]构建；单增李斯特野生型EGDe、副溶血弧菌ATCC33847实验室保存；大肠杆菌感受态细胞DH5α购自TaKaRa公司；pERL3 (单增李斯特菌表达载体，含有卡那霉素和红霉素标记) 由华中师范大学副教授罗勤馈赠。

1.2实验方法

1.2.1引物序列 引物根据美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Informa-tion,NCBI)提供序列使用Primer 3 version 4.0.0(http://primer3.ut.ee/) 设计，引物名称、序列和目的见表1。

1.2.2重组质粒的构建与鉴定 用引物对Ex-Ompk-F/R(表1)扩增副溶血弧菌ATCC33847Ompk基因，使用HindⅢ和BamHⅠ同时对该片段和表达质粒pERL3(图1A)进行双酶切；T4 DNA连接酶连接双酶切后的产物，得到重组质粒pERL3-Ompk(图1B)；分别用引物对C-Lmo0576-F/R和C-Ompk-F/R(表1)扩增单增李斯特菌EGDe的Lmo0576基因和副溶血弧菌ATCC33847Ompk基因，SalⅠ酶切两个片段后使用T4 DNA连接酶连接，使用SmaⅠ和XhoⅠ同时对连接后的片段和表达质粒pERL3进行双酶切，得到重组质粒pERL3-Lmo0576-Ompk(图1C)；用引物对P-Ompk-F/R(表1)扩增副溶血弧菌ATCC33847 带启动子Ompk基因，使用SalⅠ和XhoⅠ同时对该片段和表达质粒pERL3进行双酶切；T4 DNA连接酶连接双酶切后的产物，得到重组质粒pERL3-P-Ompk(图1D)。将获得的重组质粒导入DH5α中，同时导入空载体pERL3作对照，PCR鉴定。鉴定为阳性的克隆由上海华大基因科技有限公司测序，将测序后得到的序列与NCBI数据库进行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对。

1.2.3重组质粒电转化减毒Lm感受态细胞 根据Park等[16]方法制备EGDe-ΔactA/ΔinlB感受态细胞，用电转化法将测序正确的重组质粒导入EGDe-ΔactA/ΔinlB感受态细胞。电转参数为：电转杯加入总量10 ng质粒和100 μl感受态细胞，电场强度2.5 kV，时间4 ms；电转后菌体移入3～5 ml BHI培养基中，37℃培养1～2 h，离心弃上清后留100 ml重悬涂布于含5 μg/ml(M/V)红霉素BHI平板，37℃摇床培养48～72 h。

表1实验所需引物

Tab.1Primerusedinthisstudy

NameSequence(5'-3')PurposeofuseEx-Ompk-FATTGGATCCATGCGTAAATCACTTTTAGCConstructionofrecombinantstrainL-OEx-Ompk-RATTAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCC-Lmo0576-FGGTCCCGGGATGAAGAAAAAATACTTTCTConstructionofrecombinantstrainL-L-OC-Lmo0576-RGGTGTCGACTTATGGCTCAGGAATCAAAAC-Ompk-FATTGTCGACATGCGTAAATCACTTTTAGCConstructionofrecombinantstrainL-L-OC-Ompk-RATTCTCGAGTTAGAACTTGTAAGTTACTGCP-OmpK-FATTGTCGACTCAAACGTCCTCTTTGGTTCTConstructionofrecombinantstrainL-P-OP-Ompk-RATTCTCGAGTTAGAACTTGTAAGTTACTGCRT-Ompk-FCGGTCGCTCTGGTATTTTCGRT-PCRforgeneOmpkRT-Ompk-RAGCTCTTGAACAGGACCGAART-16s-FACATCCTTTGACCACTCTGGART-PCRforendogenousgene16sRT-16s-RCAACATCTCACGACACGAGC

图1 重组质粒的构建Fig.1 Construction of recombinant plasmidNote: A.pERL3；B.pERL3-Ompk；C.pERL3-Lmo0576-Ompk；D.pERL3-P-Ompk.

1.2.4抗原基因过表达菌株的筛选与鉴定 挑取平板中单菌落于含5 μg/ml(M/V)红霉素 BHI培养基中培养，PCR鉴定，空载体过表达菌株Lm-pERL3(L-pERL3)为阴性对照。鉴定结果为阳性的菌株分别命名为Lm-Ompk(L-O)、Lm-Lmo0576-Ompk(L-L-O)和Lm-P-Ompk(L-P-O)。

1.2.5抗原过表达菌株的生长曲线 分别取过夜培养的2 ml L-pERL3、L-O、L-L-O和L-P-O 菌株，加入到两组200 ml新鲜BHI培养基中，一组无抗生素，一组加入5 μg/ml(M/V)红霉素，使用酶标仪测定4株菌株12 h内分别在无抗生素和5 μg/ml(M/V)红霉素条件下的OD600，用数据处理软件绘制两种条件下的生长曲线。

1.2.6抗原基因转录水平的检测 为考察抗原基因Ompk在双基因缺失减毒单增李斯特菌EGDe-ΔactA/ΔinlB中的转录水平，分别提取过表达菌株Lm-pERL3、L-O、L-L-O和L-P-O的RNA后反转录成cDNA，以cDNA为模板进行SYBR Green荧光染料实时定量PCR (Real Time-PCR)，以Lm的16s核糖体RNA为内参基因，空载体菌株Lm-pERL3为基准，以2-ΔΔCt法表示Ompk基因在各菌株中的表达量[17]，Real Time-PCR所需引物见表1。

1.3统计学分析 本实验数据经Microsoft Excel与GraphPad Prism 5处理。组间的显著性差异采用One-way ANOVA 检验，组内采用两样本均数t检验。

2 结果

2.1重组质粒的PCR鉴定 将获得的重组质粒导入DH5α中，分别使用引物对Ex-Ompk-F/R、C-Lmo0576-F/C-Ompk-R和P-OmpK-F/R对重组质粒pERL3-Ompk、pERL3-Lmo0576-Ompk 和pERL3-P-Ompk 进行PCR 鉴定。如图2所示，泳道1、2在引物对Ex-Ompk-F/R PCR扩增下没有条带；泳道3在引物对Ex-Ompk-F/R PCR扩增下获得一段大小约800 bp的目的片段；泳道4在引物对C-Lmo0576-F/C-Ompk-R PCR扩增下获得一段大小约2 000 bp的目的片段；泳道5在引物对P-Ompk-F/R PCR扩增下获得一段大小约1 000 bp的目的片段。

2.2重组质粒中外源基因的测序与比对 PCR鉴定结果为阳性的克隆送由上海华大基因科技有限公司测序，将测序结果与NCBI数据库进行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对,结果如图3 所示，重组质粒pERL3-Ompk(A)、pERL3-Lmo0576-Ompk(B)和pERL3-P-Ompk(C)中外源基因与NCBI的比对结果相似性均为100%。

2.3抗原基因过表达菌株的筛选与鉴定 电转化法将重组质粒导入EGDe-ΔactA/ΔinlB感受态细胞。通过红霉素抗性压力进行筛选。利用引物对Ex-Ompk-F/R对抗性平板上的单菌落进行PCR鉴定。鉴定结果如图4所示， 泳道3、4和5均扩增出大小约为800 bp的目的片段。

图2 重组质粒PCR鉴定结果Fig.2 Identification of recombinant plasmid by PCRNote: M.500 kb DNA Ladder marker；1.H2O(negative control)；2.Empty plasmid pERL3；3.pERL3-Ompk；4.pERL3-Lmo0576-Ompk；5.pERL3-P-Ompk.

图3 重组质粒中外源基因的BLAST比对结果Fig.3 BLAST results of foreign genes in recombin-ant plasmidNote: A.BLAST result of Ompk in recombinant plasmid pERL3-Ompk；B.BLAST result of Lmo0576-Ompk in recombinant plasmid pERL3-Lmo0576-Ompk；C.BLAST result of P-Ompk in recombinant plasmid pERL3-P-Ompk.

2.4抗原过表达菌株的生长曲线 由于双敲除减毒单增李斯特菌(未携带抗性质粒pERL3)无法在含有抗生素的培养基中生长，因此使用酶标仪测定12 h 内Lm-pERL3、L-O、L-L-O和L-P-O 在OD600下的生长曲线，比较各过表达菌株在抗生素和无抗生素两种条件下的生存状况。图5表明在5 μg/ml(M/V)红霉素条件下各菌株的生长趋势较为相似，原因可能为在抗性压力下质粒的复制能力相似；在无抗性压力下，各菌株的生长趋势有所不同。另外，比较不同条件下菌株的生长情况发现抗生素对菌株的生长速度影响较小，均在4 h后达到指数生长期、9 h后达到平台期。

图4 抗原基因过表达菌株的PCR鉴定结果Fig.4 Identification of recombinant strains by PCRNote: M.DL 1 000 bp DNA ladder marker；1.EGDe-ΔactA/ΔinlB；2.Lm-pERL3；3.L-O；4.L-L-O；5.L-P-O；6.H2O(negative control)；7.Vibrio parahemolyticus ATCC33847 (positive control).

图5 过表达菌株生长曲线Fig.5 Growth curve of recombinant strainsNote: A.Growth curve of recombinant strains with Erythromycin；B.Growth curve of recombinant strains without Erythromycin.

图6 抗原基因转录水平结果Fig.6 Transcriptional analysis of Ompk gene in recom-binant strainsNote: Control.Lm-pERL3；L-O.Lm-Ompk；L-L-O.Lm-Lmo0576-Ompk；L-P-O.Lm-P-Ompk.*.P<0.05;***.P<0.001.

2.5抗原基因转录水平的检测 以Lm-pERL3为基准，RT-PCR 分别检测两种条件下L-O、L-L-O 和L-P-O中Ompk基因的表达水平。结果如图6 所示，在有、无抗生素两种条件下Ompk基因的转录水平均极显著(P<0.001)；过表达菌株在抗生素条件下Ompk基因的转录水平显著高于无抗生素条件下的转录水平(P<0.05)；另外，3株过表达菌株对Ompk基因的转录均较为成功，在L-L-O 和L-P-O中Ompk基因的表达水平稍高于L-O，但并没有显著性(P>0.05)，这可能是Ompk基因自带表达启动子，在Ompk基因上游插入启动子对其转录启动并无较大影响。

3 讨论

减毒Lm作为一种成熟的疫苗载体已经成功应用于人类免疫缺陷病毒、人类乳头瘤病毒和转移性胰腺癌等人类复杂疾病的免疫治疗中[18-20]。然而，目前将减毒Lm作为水产领域疫苗载体却鲜有报道。2001年Dietrich等[21]用Lm(EGD-e分别感染鲤鱼上皮细胞、刀剑尾鱼胚胎细胞和黑色素瘤细胞三种细胞，结果发现Lm均可在24 h内高效入侵三种细胞且无差异。早在1996年前后Horne(1997)、Menudier(1996)和Jeyasekaran(1996)等人就提出Lm有望在将来成为鱼类疫苗载体[22,23]。另外，Lm对环境耐受性强，可在较高的盐浓度、宽泛的pH值和温度范围内生长，这种超强的环境适应能力拓宽了载体疫苗的使用范围。

本研究通过质粒携带构建了3株Ompk抗原过表达菌株，分别为L-O、L-L-O和L-P-O。测序结果显示过表达菌株中外源基因的序列与NCBI 序列完全相同，说明Ompk基因随表达质粒正确转化入减毒Lm中。RT-PCR结果显示Ompk基因在3株过表达菌株中成功转录，且转录水平极为显著。在抗生素条件下，Ompk基因在各过表达菌株中的表达水平显著高于在非抗性条件下的转录水平，这是由于过表达菌株中质粒在抗性压力下的复制倍数较高。在L-L-O和L-P-O中Ompk基因的表达水平稍高于L-O，但并没有显著性，这可能是Ompk基因自带表达启动子，在Ompk基因上游插入启动子对其转录启动并无较大影响。随着基因编辑技术的不断发展，工程菌株的构建技术不断成熟。除质粒携带外源基因表达以外，另外一种染色体插入的基因编辑手段相对较为稳定，如基于平衡致死减毒Lm疫苗载体的设计[24]。另外，疫苗菌株中外源蛋白的表达量和对宿主产生的免疫效果也是评价活载体疫苗的一个主要指标。除Ompk蛋白以外，Li等[25]证实副溶血弧菌中的外膜蛋白VP0802氨基酸序列与其他弧菌具有70%左右的同源性且具有很好的免疫原性，同样是制备亚单位疫苗的良好候选材料。相信随着生物信息学技术和基因编辑手段的不断发展，基于减毒Lm为载体，以弧菌共同抗原等为靶标的弧菌水产疫苗有望在不远的将来实现。

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[收稿2017-02-17 修回2017-05-03]

(编辑 张晓舟)

Constructionofvibriovaccinestrainandexpressionofantigengene:attenuatedListeriamonocytogenesasvaccinevector

DINGCheng-Chao,CHENGuo-Wei,XIEMan-Man,GUOLiang,LIJie,SUNJing-Juan,LIUQing.

SchoolofMedicalInstrumentandFoodEngineering,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China

Objective:To provide a potential platform for transferring specific antigen against fish bacterial diseases based on attenuated Lm (EGDe-ΔactA/ΔinlB).Methods: Attenuated Lm (EGDe-ΔactA/ΔinlB) was used to express outer membrane protein K (Ompk),a conserved and effective vaccine candidate in vibrio.The identification of recombinant strains and detection of antigen genes were operated with PCR and RT-PCR,respectively.Results: The results of PCR showed that Lm-Ompk (L-O),Lm-Lmo0576-Ompk (L-L-O) and Lm-P-Ompk (L-P-O) were constructed successfully.The identity of foreign gene was 100% compared with sequence of NCBI.The analysis of transcription showed that the expressions ofOmpkin L-O,L-L-O and L-P-O were significant (P<0.001).Moreover,the expression ofOmpkin the condition of antibiotic was higher than that in the BHI without antibiotic (P<0.05).Conclusion: Lm-Ompk (L-O),Lm-Lmo0576-Ompk (L-L-O) and Lm-P-Ompk (L-P-O) were constructed successfully.

AttenuatedListeriamonocytogenes;Vaccine vector;Vibriovaccine;Ompk;Antigen gene

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.001

①本文受国家自然科学基金面上项目(31371776)和上海市研究生教育创新计划资助。

丁承超(1992年-)，男，在读博士，主要从事病原微生物疫苗研究，E-mail：ding10118026@163.com。

及指导教师：刘 箐(1970年-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事食源性致病菌致病机理及控制研究，E-mail：liuq@usst.edu.cn。

Q78

A

1000-484X(2017)09-1281-06