蕨菜组织培养技术研究现状及发展趋势

韩喜国+任英+聂振波

摘 要：从目前蕨菜组织培养技术现状出发，阐述了外植体、培养基成分、消毒方式及外源添加物对培养效果的影响，并对蕨类组织培养存在的问题、发展趋势及前景进行分析和讨论。

关键词：蕨菜；组织培养；影响因素；发展趋势

中图分类号：S647 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2017）16-0030-04

蕨菜是医食两用的林下野生蔬菜，具有极高的经济价值和保健功能。基于需求量和持续性发展的要求，其繁殖方式越来越受到研究者及生产者的关注。目前，蕨菜人工驯化繁殖方式主要有3种：根茎繁殖、孢子繁殖和组织培养繁殖。根茎繁殖虽然简单易操作，成株率和成活率较高，但费工费时且对野生资源破坏严重；孢子繁殖虽应用广泛，但从孢子萌发到孢子体形成和生长，期间所需环境条件极其严苛，而孢子萌发所需温、湿度与真菌孢子萌发的条件相似，导致孢子繁殖成苗率低；组织培养是近年来备受重视的一种快速繁殖方法，它具有取材少、成苗量大、不受季节限制、速度快等优点。

目前，蕨菜组织培养所用外植体材料可分为配子体和孢子体2类，配子体包括孢子和原叶体；孢子体包含根状茎、叶柄、幼叶等。从适宜的外植体、培养基种类、成分、激素的种类及用量、有机物的添加及培养条件等方面对蕨类组织培养进行了研究。

1 蕨菜组织培养技术

1.1 以孢子为外植体的组培技术

一般以MS和1/2 MS为基本培养基，附加2%蔗糖、0.5%琼脂，pH值5.8～6.0，根据需要加入植物生长调节剂。然后将培养基在120℃高压灭菌锅中灭菌30 min备用。

将采集到的成熟孢子用无菌滤纸包好，曲别针固定封口，将纸包置于70%的酒精溶液中消毒30 s，无菌蒸馏水清洗2次，再用0.1% HgCl2消毒150 s，无菌水清洗4～5次。然后用滴管吸取孢子溶液，滴于准备好的培养基中。培养室温度控制在25℃左右，光强2 500～3 000 lx，每天保证16 h光照。

郭宇兰等[1]认为，在孢子组织培养的过程中，孢子萌发与无机盐浓度有关，过高过低都不利于孢子萌发及原叶体形成，适宜的培养基为MS和1/2 MS；最适宜的增殖培养基为：1/2 MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L；最适宜的生根培养基为1/2 MS+NAA 0.05 mg/L+IBA 0.2 mg/L。生根率达98.6%。

1.2 以原叶体为外植体的组培技术

1/2 MS为基本培养基，pH值5.8，在压力1.0～1.2 kg/cm2，经20～25 min 高压灭菌待用。

取成形的原叶体，用清水漂洗干净，0.1% HgCl2消毒5～8 min，再用酒精消毒30 s，最后用无菌水冲洗3～5次，接种到准备好的培养基上。培养温度20～28℃，光照时间3～10 h，光照强度1 500～2 000 lx，培养时间1～2个月。最适宜的原叶体增殖培养基为：1/2 MS +6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L；草炭+松针土是适合原叶体生根的最佳基质[2]。

1.3 以叶柄为外植体的组培技术

1/2 MS为基本培养基，添加蔗糖30 g/L，琼脂

8 g/L，高温高压灭菌后备用。取幼嫩蕨菜叶柄冲洗净浮土，再用洗洁精溶液浸泡10 min，之后用软毛刷多次刷洗，用自来水冲洗至无泡沫，再用75%酒精消毒20 s，后用0.1% HgCl2消毒5 min，最后用无菌水冲洗4～5次，无菌滤纸吸干表面水分后接种到准备好的培养基上。培养温度为25℃，光照强度

2 000 lx，光照时间为每天13 h。方利娟等[3]、姜长阳等[4]研究证明，蕨菜叶柄诱导愈伤组织的最佳培养基是1/2 MS+0.2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IBA；愈伤组织增殖最佳培养基是1/2 MS +0.2 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA，增殖倍数为8.07；不定苗的生根诱导最佳培养基为1/2 MS+0.4 mg/L IBA[3]。

1.4 以根状茎为外植体的组培技术

采集根状茎幼嫩先端0.5～1.0 cm，先用75%酒精浸30 s，无菌水冲洗3次，转入1.0% HgCl2中消毒5 min，再用无菌水冲冼3～5次，无菌纸吸干表面水分。基本培养基为1/2 MS培养基附加1.0～1.5 g/L活性炭[5]。

适合诱导分化的培养基为1/2 MS+1.5 g/L活性炭+KT 2.0 mg/L+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

适合继代培养的培养基为1/2 MS+1.5 g/L活性炭+KT 2.0 mg/L+NAA 0.2～0.5 mg/L。

适合壮苗培养的培养基为1/2 MS+1.5 g/L活性炭+6-BA 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1～1.0 mg/L+GA3 0.2～0.5 mg/L+水解乳蛋白0.1%。

适合生根诱导的培养基为1/2 MS+1.5 g/L活性炭+NAA 0.5 mg/L[6]。

目前，在以上几种蕨菜组织培养中，以孢子和根状茎为外植体的组培技术应用比较广泛，且容易成功获得组培苗。

2 影响蕨菜组织培养效果的因素

2.1 外植体和基本培养基的选择

以孢子体为外植体，重要的是对外植体材料质量的选择和审定。外植体材料生理和营养的不同可能会导致组织培养工作的混乱。经过在30 余种培养基类型上的实践证明，蕨菜不同类型的外植体中，以地下茎（根状茎）最幼嫩的包括生長点在内的先端一小段，经过诱导才具有产生大量不定芽的能力[6]，也最易诱导形成愈伤组织。选择配子体材料进行组织培养时，如果能获得孢子，大多采用孢子作为外植体。endprint

蕨菜组培应用的基本培养基大体有MS、1/2 MS、Knop、N6等，在用孢子体材料作初代培养或继代增殖阶段应使用较高无机盐浓度的基本培养基，1/2 MS最为常用。在孢子萌发、分化成苗、生根阶段应使用低盐浓度的基本培养基，如Knop、1/8 MS等，因为高盐浓度往往抑制孢子萌发。全MS培养基对提高孢子的萌发量效果最佳。1/2 MS培养基则有利于蕨的组织培养中诱导出绿色小球GGB，进而诱导出丛生芽，分化出苗。但因蕨菜种类繁多，生育特性不同，对培养基成分的要求也有所不同：MS培养基对波士顿蕨和黑心蕨效果良好。

2.2 消毒方法对组织培养的影响

外植体消毒是组织培养技术的第一步基础工作，也是最重要的步骤，消毒不彻底可能导致整个过程的成败。植物组织培养中外植体的成活率与污染率不成一定的比例。蕨菜组织培养外植体消毒一般采用0.1%～1.0% HgCl2、70%～75%酒精等常用消毒剂。HgCl2虽然杀菌力强，但对外植体的伤害也很大，且不易去除，所以一般使用浓度不超过1.0%，而且要严格把握时间。李荣峰等[7]对蕨菜幼嫩茎段的消毒试验表明，在消毒时间相同的前提下，随着HgCl2浓度的递增，污染率降低，成活率先增后减，在1.0%时达到最大值；在相同的HgCl2浓度下，随着消毒时间的延长，污染率和成活率都呈下降趋势。由此证明，高浓度、长时间的HgCl2消毒虽然降低了污染率，但同时也降低了成活率。另外，同样的消毒时间和方法对不同大小的外植体效果也不同，将大块的外植体消毒后再切成合适大小接种比把外植体切成合适大小消毒后再接种效果要好，并且成活率也较高。

2.3 外源激素对组织培养的影响

外源激素常用的有：植物生长素GA3、IAA、NAA或IBA；细胞分裂素BA、KT等。

孢子萌发期：GA3能有效打破孢子休眠，促进上一年常温保存的孢子提早萌发，并能提高萌发率，而对当年的孢子只有促进提早萌发的作用，不能提高萌发率[8]。

愈伤组织诱导与增殖：在不含有任何激素的

1/2 MS 培养基中愈伤组织诱导率极低，向培养基中添加了6-BA、IBA、NAA后，诱导率与增殖率均有所提高。方利娟等[9]的试验表明，0.2 mg/L的6-BA和0.4 mg/L的IBA或NAA是诱导愈伤组织的最佳

浓度，这与周晓丽等[10]、华智锐等[11]的研究结果相近。而KT、Zip和Zeatin等细胞分裂素在适宜的水平均具有较好的诱导芽增殖的效果。

2.4 糖源对愈伤组织诱导及世代转换的影响

在蕨类植物的组培中，一般以蔗糖为糖源，其次为葡萄糖。高浓度的糖会抑制孢子萌发，但加入适量的糖有利于原叶体的进一步生长发育。华智锐等[11]试验表明，1/2 MS培养基中加入30 g/L的蔗糖，愈伤组织诱导率为20.6%，比蔗糖浓度15 g/L的诱导率高18.4%，但有关蔗糖的最佳浓度尚无定论。糖源对蕨类植物的世代转换也有重要的影响。一般认为在无糖源或在低糖源水平的饥饿状态下， 容易诱导无孢子生殖，而含高浓度糖的培养基有利于无性生殖配子体的诱导。

3 存在的问题及发展趋势

尽管蕨类植物有很多组织培养成功的报道，但真正用于大规模商业化生产的并不多。因为在目前的蕨类组织培养技术条件下，组培苗生长缓慢、污染严重、成活率低、成本过高、炼苗阶段的小苗存活率低等，都是阻碍蕨类组培技术发展的突出问题。为此，国内外的学者将环境控制技术和组培技术有机的结合起来做了大量研究。

3.1 采用新技术

由于传统的组培技术中使用的含糖培养基极易受到污染，日本千叶大学古在丰树教授发明了一种全新的植物组培技术——无糖组培技术[12]，其优点是用CO2气体代替常规培养基中的糖源作为组培过程中所需要的碳源，通过环境控制技术，为组培苗提供生长发育所需的光、温、水、气、营养等条件，避免了因污染而引起的损失，减少了生理及形态的异常。

3.2 改善培养方式

利用气升式生物反应器[13]进行组织培养，是一种模仿蕨类植物自然生长环境的培养方式，以蕨菜在自然界里生长的土壤为基质，做适当调节，消毒灭菌应用于组织培养。它具有更强的抗杂菌能力，流动性也更为均匀，结构简单易操作。目前，这种培养方式已用于蕨类生产。

3.3 通过培育健壮的组培苗、调控环境因素、选择适宜的基质来提高蕨菜组培苗的成活率

近年来，多项组培新技术应运而生 ，如植物开放式组织培养、无糖组培技术（光独立培养法）、多因子综合控制技术、新型光源的应用等[14]，这些新技术弥补了传统组培技术的缺陷，如能将其引入蕨类组织培养中，无疑将推动蕨类组培技术的创新和在生产中的应用。蕨菜种类繁多，还有许多有价值的蕨類植物需要通过组培技术进行研究和开发，以实现蕨菜高品质、低成本的规模化生产。

参考文献

[1] 郭宇兰，陈宇.蕨菜孢子组织培养技术的研究[J].中国林副特产，2012（6）：32-33.

[2] 刘瑞林，佟立君，王绪.蕨菜原叶体组织培养及植株再生[J].中国林副特产，2006（3）：12.

[3] 方利娟，苏仕林，蒲仕明.蕨菜组织培养技术的研究[J].安徽农业科学，2012（6）：3 239-3 240，3 262.

[4] 姜长阳，宁淑香，于淼，等.蕨菜愈伤组织高效再生体系的建立[J].园艺学报，2003（3）：343-345.

[5] 吴春华，石元亮，王淼.蕨菜根状茎的组织培养技术研究[J].园艺与种苗，2013（11）：41-44.

[6] 赵彦芳，娄和林，雷秀云.山蕨菜组织培养的研究[J].辽宁大学学报，2000（1）：76-78.

[7] 李荣峰，蒲仕明，方利娟.蕨菜组织培养的消毒方法比较[J].湖北农业科学，2013（16）：3 852-3 855.endprint