猪胚胎发育与胚胎工程研究进展

郭诗萌，刘世超,2，刘忠华,3*

（1. 东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.东北农业大学动物科学与技术学院，黑龙江哈尔滨150030；3.黑龙江省细胞与遗传工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150030）

猪胚胎发育与胚胎工程研究进展

郭诗萌1，刘世超1,2，刘忠华1,3*

（1. 东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.东北农业大学动物科学与技术学院，黑龙江哈尔滨150030；3.黑龙江省细胞与遗传工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150030）

编者按

2017年《中国畜牧杂志》全面改版。为更好展示畜牧学领域的科技前沿，促进学术交流，本刊特别邀请不同领域的专家或青年骨干，围绕各自的研究领域，介绍自己、团队或国际研究机构近几年的研究成果、存在问题及研究展望，或就当前的研究热点问题进行讨论和评论。2017年第一期自副主编开始，将为读者带来相关综述，希望能引发读者对相关热点、难点的思考，并进行深入探讨。

早期胚胎发育研究是认知特定物种个体发生、发育规律的基础，胚胎工程研究是实现按照人类的意愿对个体进行遗传性状改变的主要途径。小鼠胚胎发育和胚胎工程研究成果为现代生物学和医学发展做出了巨大的贡献。但人类对其他哺乳动物早期胚胎发育规律的认知和胚胎操作技术的掌握与小鼠相比仍有较大差距，这种状况阻碍了生命科学与技术最新成果在动物生产领域的转化应用。

猪在畜牧生产和生物医学模型方面都具有重要价值，因此与猪相关的基础生物学研究受到的关注也多于其他家畜，成为小鼠等小型实验哺乳动物之外研究热度较高的大型哺乳动物之一。本文以猪为例，对家畜胚胎发育和胚胎工程研究进展进行概括性的综述，希望能够为从事该领域工作的研究者提供参考。

1 胚胎体外生产及胚胎发育机制

经济成本决定了猪等大家畜无法依赖体内获取胚胎用于相关研究，因此卵母细胞体外成熟、胚胎体外生产和胚胎体外培养等技术体系逐渐得到发展，成为开展家畜胚胎发育研究和胚胎工程操作的基础。目前卵母细胞体外成熟培养体系多以TCM199为基础液，添加适当浓度的促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）以及表皮生长因子（EGF）等生长因子构成，有些体系也会添加胎牛血清或者卵泡液来促进成熟[1]。虽然与体内成熟卵母细胞在质量和发育潜能方面仍有差距，但猪、牛、山羊和绵羊的体外成熟卵母细胞均可支持个体出生。最新报道指出，通过向成熟体系中添加成纤维细胞生长因子2（FGF2）、白血病抑制因子（LIF）和胰岛素样生长因子（IGF1）可以使得猪卵母细胞体外成熟率、体外囊胚发育率和胚胎移植后的仔猪出生率大幅提高[2]。该体系是否也适用于其他物种，或者是否可以促进其他物种卵母细胞体外成熟体系的发展仍有待观察。

体外受精、精子注射和体细胞核移植是体外生产家畜胚胎的主要方式。在过去三十余年的探索积累下，上述体外生产胚胎的技术体系在以猪为代表的家畜中都可以稳定获得出生的个体，但如何提高生产效率和稳定胚胎质量仍有待继续探索。最近有消息称，天津市农业科学院畜牧兽医研究所和南开大学机器人与信息自动化研究所跨学科合作，实现了机器人显微操作进行克隆猪的生产。无疑以人工智能为基础的机器人显微操作将极大提高该类工作的效率和稳定性，值得关注和期待。

以猪为代表的家畜早期胚胎发育模式与小鼠差异较大，在卵裂球命运决定和分化机制方面可能也存在种间差异[3]。因此，对猪等家畜早期胚胎发育调控机制的解析对于理解该物种特异性发育问题具有不可替代性。

近几年来，随着干细胞和再生医学以及异种器官移植相关研究的飞速发展，由于与人类器官生理结构以及生活习惯的相似性，猪已经成为目前最有希望的待移植人类器官生产者。因此，关于人猪早期胚胎嵌合体以及早期胚胎发育相似性的研究工作极大地推动了猪早期胚胎发育机理的研究。以往研究表明，小鼠着床前胚胎第一次谱系分化过程中，转录因子Cdx2和OCT4相互抑制并促进各自细胞向滋养层和内细胞团分化[4]。而在猪和人早期胚胎中，研究者发现Oct4基因在囊胚滋养层和内细胞团中广泛表达，在早期囊胚期Cdx2基因在滋养层细胞中表达量非常低，甚至部分滋养层细胞中没有Cdx2基因的表达[5-7]。这表明猪与人早期胚胎发育的分子基础相似，但与小鼠有着巨大差别。另一方面异种嵌合的相关研究表明，将人胚胎干细胞注射到猪桑椹胚中可以产生人-猪嵌合体胎儿，但是同样的操作无法产生鼠-猪嵌合体胎儿[8]，这说明人类干细胞可以同步参与到猪早期胚胎分化过程中，也从侧面说明了人和猪早期胚胎发育的相似性。此外，最新研究表明，人和猪原始生殖细胞的发源地以及分化的分子机理极其相似，但与小鼠存在巨大差别[9]。

相对于小鼠等模式动物，猪体内胚胎获取的成本高，体外胚胎培养体系效率低，最重要的是针对于早期胚胎相关的实验体系不健全。这导致过去几十年来猪早期胚胎发育的相关研究工作相对缓慢。但随着对其医疗和科研价值的深入认识，猪早期胚胎发育的研究工作正处于加速起跑的阶段，相信在不远的将来会产生更多更具有影响力的研究成果。

2 多能性干细胞系

小鼠胚胎干细胞（ESC）系是最早建立的多能性干细胞系[10]，它的生物学特征也为多能性设定了标准。能够实现生殖系嵌合发育或者四倍体嵌合发育的干细胞系拥有的多能性被定义为初始态（naive）多能性；具有体外自我更新能力和三胚层分化能力，但不具有生殖系嵌合发育或者四倍体嵌合发育能力的干细胞系拥有的多能性被定义为激发态（primed）多能性。在小鼠ESC和诱导多能性干细胞（iPSC）[11]取得成功后，尝试建立其他哺乳动物ESC和iPSC的努力一直没有中断，也取得了一系列进展。但总体来看，目前以猪为代表的其他物种多潜能干细胞都没有达到小鼠ESC的全部生物学特征，大部分处于接近激发态多能性状态[12-13]。探索适合于每个物种初始态多能性干细胞的培养体系或者找到各物种通用的初始态多能性干细胞培养体系是目前该领域的主要任务。

3 基因编辑

向哺乳动物基因组导入外源基因最初是通过原核注射在小鼠中实现的[14]，采用同样的技术路线，其他哺乳动物也相继取得了成功。但自从小鼠ESC建立之后，小鼠的基因操作取得了大幅的进展。ESC与基因打靶技术相结合可以在个体水平实现各种类型的基因操作，如外源基因定点导入、特定基因敲除和特定基因的条件性敲除等。由于没有等同于小鼠ESC的细胞可用，大型哺乳动物的基因操作进展缓慢，直到2002年才通过体细胞核移植路线首次实现基因敲除[15]。锌指核酸酶、TALEN和CRISPR/Cas9工具体系的出现，使大型哺乳动物基因打靶变得相对容易实现，也促使基因编辑概念的提出，并相继出生了基因编辑大型哺乳动物[16-17]。考虑到猪等家畜的妊娠周期和饲养管理成本，受精卵直接操作路线和体细胞基因编辑后进行核移植路线都存在不尽如人意之处。在降低成本、提高效率和多基因编辑等方面，猪等大动物多能性干细胞系的建立仍具有重要的意义。

4 展望

以猪为代表的家畜胚胎发育和胚胎工程研究对畜牧生产发展和人类生物医学进展具有重要的促进作用。生命科学和生物技术的整体进步为家畜胚胎发育和胚胎工程研究提供了更为丰富的探索路径和探索空间。如何提高家畜胚胎体外生产的效率和质量仍将是未来一定时间内的重要任务；借助高通量技术在基因组学、转录组学、蛋白质组学和表观组学等层面深入阐明家畜物种特异性胚胎发育调控机制是领域的总体发展趋势；建立初始态多能性干细胞系，结合最新基因编辑技术，按照人类的需要在家畜上高效实现多基因编辑操作是未来五到十年内可以实现的目标。

[1] 刘忠华, 田江天, 郑重, 等. 体细胞核移植克隆民猪: 培养液对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响[J]. 中国科学 C辑: 生命科学, 2007, 37(6):634‐640.

[2] Yuan Y, Spate L D, Redel B K, et al. Quadrupling efficiency in production of genetically modified pigs through improved oocyte maturation[J]. Proc Natl Acad Sci, 2017, 114: E5796‐E5804.

[3] Bou G, Liu S C, Sun M J, et al. CDX2 is essential for cell proliferation and polarity in porcine blastocysts[J]. Development, 2017, 144:1296‐1306.

[4] Niwa H, Toyooka Y, Shimosato D, et al. Interaction between Oct3/4 and Cdx2 determines trophectroderm dif f erentiation[J]. Cell, 2005,123:917‐929.

[5] Strumpf D, Mao C A, Yamanaka Y, et al. Cdx2 is required for correct cell fate specification and differentiation of trophectoderm in the mouse blastocyst[J]. Development, 2005, 132:2093‐2012.

[6] Chen A E, Egli D, Niakan K, et al. Optimal timing of inner cell mass isolation increases the efficiency of human embryonic stem cell derivation and allows generation of sibling cell lines[J]. Cell Stem Cell, 2009, 4:103‐106.

[7] Liu S, Bou G, Sun R, et al. Sox2 is the faithful marker for pluripotency in pig: evidence from embryonic studies[J]. Dev Dynam, 2015, 244:619‐627.

[8] Wu J J, Platero‐Luengo A, Sakurai M, et al. Interspecies Chimerism with mammalian pluripotent stem cells[J]. Cell, 2017, 168:473‐486.

[9] Kobayashi T, Zhang H, Tang WWC, et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems[J]. Nature, 2017, 546:416.

[10] Evans M J, Kaufman M H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J]. Nature, 1981. 292: 154‐156.

[11] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by def i ned factors[J].Cell, 2006, 126:663‐676.

[12] Fan N, Chen J, Shang Z, et al. Piglets cloned from induced pluripotent stem cells[J]. Cell Res, 2013, 23:162‐166.

[13] Xue B H, Li Y, He Y L, et al. Porcine pluripotent stem cells derived from IVF embryos contribute to placenta development[J]. PLoS One, 2016, 11(3):e0151737.

[14] Palmiter R D, Chen H Y, Brinster R L. Differential regulation of metallothionein‐thymidine kinase fusion genes in transgenic mice and their of f spring[J]. Cell, 1982, 29:701‐710.

[15] Lai L, Kolber S D, Park K W, et al. Production of alpha‐1,3‐galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning [J]. Science, 2002, 295:1089‐1092.

[16] Xin J, Yang H, Fan N, et al. Highly efficient generation of GGTA1 biallelic knockout inbred mini‐pigs with TALENs[J]. PLoS One, 2013, 8(12):e84250.

[17] Huang L, Hua Z, Xiao H, et al. CRISPR/Cas9‐mediated ApoE‐/‐ and LDLR‐/‐ double gene knockout in pigs elevates serum LDL‐C and TC levels[J]. Oncotarget, 2017, 8(23):37751‐37760.

10.19556/j.0258-7033.2017-09-001

国家重点研发项目；猪初始态（naive）多能干细胞系建立及多能性调控机制解析（2016YFA0100200）；国家自然科学基金面上项目；猪早期胚胎发育中CDX2和OCT4基因功能及互作模式研究（31371457）

郭诗萌，在读博士，主要从事猪胚胎发育调控机制研究，E-mail：guoshimeng217@neau.edu.cn

*通讯作者：刘忠华，E-mail：liuzhonghua@neau.edu.cn