非T细胞结合肽(FNS007)对胶原诱导型大鼠关节炎的影响①

李立萍 刘 超 解丽君 黄丽晶 郝 娜 葛 兰 闫少峰 李国风 许晓红 张勤增李兰芳 姜 红 张建新

(河北省疾病预防控制中心药物研究所,石家庄050021)

非T细胞结合肽(FNS007)对胶原诱导型大鼠关节炎的影响①

李立萍 刘 超②解丽君 黄丽晶②郝 娜 葛 兰②闫少峰②李国风 许晓红②张勤增李兰芳 姜 红 张建新

(河北省疾病预防控制中心药物研究所,石家庄050021)

目的：探讨非T细胞结合肽(FNS007)对大鼠Ⅱ型胶原(Collagen typeⅡ,CⅡ)诱导的关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)的影响及可能机制。方法：以牛CⅡ免疫Lewis大鼠诱发CIA模型后，随机分为模型组、FNS007低(0.25 mg/kg)、中(0.5 mg/kg)、高(1.0 mg/kg)剂量组及阳性药(甲氨蝶呤)组，另设空白对照组，尾静脉注射相应药物，隔天一次,空白对照组及模型组大鼠给予溶媒磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered solution,PBS)。实验期间观察踝关节宽度以及爪厚度，关节炎评分。给药后第22天处死大鼠，ELISA法测定血清中TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平及抗CⅡ抗体水平；X光分析FNS007对CIA大鼠后爪骨损伤的疗效，并对大鼠踝关节进行组织病理学检查。结果：FNS007 高剂量明显抑制CIA大鼠足爪肿胀程度，爪厚度和踝关节宽度明显降低；炎症评分明显降低； 血清促炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的含量和抗CⅡ抗体的水平明显降低； X光评分和组织病理评分明显降低。FNS007 中剂量和低剂量组的以上指标也有不同程度的改善。结论：FNS007对大鼠CIA具有治疗作用,其机制与其抑制T细胞活化，抑制CIA大鼠体内抗CⅡ 的产生，并降低促炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的含量，从而抑制异常免疫反应有关。

非T细胞结合肽(FNS007)；胶原诱导型关节炎；类风湿关节炎；大鼠

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以关节滑膜慢性炎症为主的自身免疫性疾病，主要临床表现为慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变，可引起关节肿痛，继而导致软骨破坏，引起关节畸形，最终出现不同程度的残疾[1,2]。目前RA的治疗以缓解病情的抗风湿药和非甾体抗炎药为主，此类药物作用于发病的非起始环节，难以从根本上控制病变。本实验中，非T细胞结合肽(FNS007，又称NTAP)是直接针对 T 细胞发生作用的新型生物制剂，作用于RA发病的起始环节，抑制T细胞激活的第一信号 “T细胞受体(TCR) -抗原肽-人类白细胞 DR 抗原(HLA- DR)”三分子复合物的形成,与Ⅱ型胶原(CⅡ)原型肽竞争性结合HLA-DRβ1，进而抑制CⅡ引起的T细胞的增殖，从类风湿关节炎发病的中心环节遏止疾病的发生和发展，达到治疗的目的。本文在前期研究基础上在整体动物层面探索FNS007的作用效果及机制，为其应用于临床治疗RA提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及试剂 雌性Lewis大鼠，SPF级，6～7周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。牛Ⅱ型胶原蛋白(Collagen typeⅡ，Chondrex公司)；不完全弗氏佐剂(Incomplete Freund′s adjuvant,IFA)购自Chondrex公司；FNS007(河北菲尼斯生物技术有限公司)；注射用甲氨蝶呤购自江苏恒瑞医药股份有限公司；大鼠肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(96孔，RD公司)；大鼠CⅡ抗体ELISA试剂盒(96孔，Chondrex公司)。

1.2方法

1.2.1造模和给药方法 冰浴条件下， 0.05 mol/L醋酸溶液与牛Ⅱ型胶原混匀，胶原的终浓度为2 mg/ml，放置在4℃过夜。次日，将胶原溶液与等体积IFA混合，冰浴搅拌至完全乳化为油包水白色乳液，胶原的终浓度为1 mg/ml。将100 μl乳化剂于大鼠的尾根部皮内注射进行免疫，7 d后同法加强免疫1次[3]，观察大鼠四肢关节肿胀情况，炎症评分为1分时，随机入组给予治疗。

造模成功大鼠随机分为模型组、FNS007低剂量(0.25 mg/kg)组、FNS007中剂量(0.5 mg/kg)组、FNS007高剂量(1.0 mg/kg)组和阳性药[4](甲氨蝶呤，0.5 mg/kg)组，另设空白对照组。每组动物12只。FNS007 治疗组隔天给药一次，阳性药每周给药两次，模型组和空白组给予PBS(隔天一次)，尾静脉注射给药，连续给药21 d，于给药后第22天处死大鼠。

1.2.2爪厚度和踝关节宽度测量 游标卡尺测量大鼠后爪厚度和踝关节宽度，从入组当天开始，隔天一次，直至给药结束。

1.2.3CIA炎症评分及标准 大鼠的每个爪子最高评为4分，每只大鼠最高评为16分，具体标准如下：0分=无关节红肿；1分=关节轻度红肿；2分=关节中度红肿；3分=关节重度红肿；4分=关节畸形或不能负重。大鼠入组后隔天进行一次评分，直至给药结束。

1.2.4TNF-α、IFN-γ、IL-6和抗CⅡ抗体水平测定 治疗结束后，麻醉处死大鼠，腹主动脉取血，采用ELISA法测定血清中TNF-α、IFN-γ、和IL-6的水平以及血清中抗CⅡ抗体的水平。具体测定方法严格按照说明书。

1.2.5放射学检查 治疗结束后，麻醉处死大鼠，摘取后爪，采用柯达多模态小动物活体成像仪进行X光摄像，对所获得的图像进行跖骨损伤的评价，具体评分标准[5]如下：0分=关节间隙正常，骨轮廓完整；1分=1或2个外侧跖骨出现轻微骨侵蚀；2分=第三到第五外侧跖骨出现明显的骨破坏；3分=所有外侧跖骨均出现骨破坏，同时伴有第一、第二内侧跖骨的明显骨侵蚀；4分=所有跖骨均出现明显骨破坏，伴有至少一个内侧的跖骨关节完全毁损，只保留部分骨轮廓；5分=多处畸形毁损，骨轮廓消失。

1.2.6大鼠踝关节病理学检查 大鼠踝关节经脱钙、石蜡包埋、4 μm切片、HE染色后，进行组织损伤评价，具体评分标准如下：0分=正常滑膜组织；1分=滑膜增生，炎性细胞浸润；2分=血管翳形成，软骨侵蚀；3分=大部分软骨破坏伴软骨下骨侵蚀；4分=关节完整性丧失，关节强直。

2 结果

2.1各组大鼠爪厚度测定结果 与空白组比较，模型组大鼠的爪厚度在第1～21天明显升高(P<0.01)。与模型组比较，甲氨蝶呤组的爪厚度在第3、11、17、19和21天明显降低(P<0.05，P<0.01)；FNS007高剂量组在第3～21天明显降低(P<0.05，P<0.01)；中剂量组的爪厚度在第3、5和7天明显降低(P<0.05，P<0.01)(图1)。

2.2各组大鼠踝关节宽度测定结果 与空白组比较，模型组大鼠踝关节宽度在第1～21天明显升高(P<0.01)。与模型组比较，甲氨蝶呤组大鼠踝关节宽度在第9、11、17和19天明显降低(P<0.05)。FNS007高剂量组大鼠踝关节宽度在第3～21天明显降低(P<0.05,P<0.01)(图2)。

图1 FNS007对CIA大鼠爪厚度的影响(mm)Fig.1 Effect of FNS007 on paw thickness (mm) in CIA miceNote: ##.P<0.01 compared with control group;*.P<0.05,**.P<0.01 compared with model group.

图2 FNS007对CIA大鼠踝关节宽度的影响(mm)Fig.2 Effect of FNS007 on ankle joint width (mm) in CIA miceNote: ##.P<0.01 compared with control group;*.P<0.05,**.P<0.01 compared with model group.

2.3各组大鼠炎症评分情况和时间曲线下面积(AUC)的变化 为了反应药物对该指标整个病程的影响，并对药物的整体作用效果进行评价，对炎症评分AUC进行分析，与空白组比较，模型组大鼠的炎症评分AUC明显升高(P<0.01)；与模型组比较，甲氨蝶呤组的炎症评分AUC明显降低(P<0.05)；FNS007中、高剂量组炎症评分AUC明显降低(P<0.05,P<0.01)(表1)。

2.4各组大鼠血清细胞因子测定结果 模型组大鼠血清中TNF-α、IFN-γ和IL-6水平较空白组明显升高(P<0.01)，与模型组相比， FNS007高剂量组大鼠血清中的TNF-α、IFN-γ和IL-6水平明显降低(P<0.05,P<0.01)(表2)。

2.5各组大鼠血清抗CⅡ抗体水平测定结果 模型组大鼠血清中的抗CⅡ抗体水平较空白组明显升高(P<0.01)，FNS007高剂量组大鼠血清中的抗CⅡ抗体水平明显降低(P<0.05)(表2)。

2.6FNS007对CIA大鼠X光评分的影响 实验结束后对各组大鼠进行后爪关节X线摄片及评分，结果显示,模型组大鼠可见大部分关节软组织重度肿胀，关节间隙变窄，软骨和骨质侵蚀破坏,甚至骨关节完全毁损。FNS007治疗后关节破坏不同程度的减轻。X线评分显示：与空白组比较，模型组大鼠的X光评分明显升高(P<0.01),与模型组比较，FNS007高剂量组X光评分明显降低(P<0.01)(图3和表3)。

表1FNS007对CIA大鼠炎症评分AUC的影响

Tab.1EffectofFNS007onAUCarthritisscoresofCIAmice

GroupsDosage(mg/kg)AUCarthriticscoresControlgroup-0.00±0.00Modelgroup-98.42±46.081)Methotrexategroup0.5058.50±22.722)Lowdosegroup0.2566.67±35.53Middledosegroup0.5062.58±41.952)Highdosegroup1.0047.42±38.623)

Note：1)P<0.01 vs control group;2)P<0.05,3)P<0.01 vs model group.

表2FNS007对CIA大鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-6和抗CⅡ抗体水平的影响

Tab.2EffectsofFNS007onTNF-α，IFN-γ，IL-6andanti-CⅡantibodylevelinserumofCIArats

GroupsTNF-α(ng/L)IFN-γ(ng/L)IL-6(ng/L)anti-CⅡantibody(μg/ml)Controlgroup32.35±3.86162.35±16.0212.85±2.34513.09±54.45Modelgroup47.81±5.251)204.67±22.761)21.98±7.011)3770.68±1722.891)Methotrexategroup47.27±5.67204.91±17.2717.23±2.362)2843.68±641.40Lowdosegroup45.37±6.29194.34±13.5517.76±7.313868.88±1758.99Middledosegroup44.00±5.55202.68±15.0320.84±2.363477.86±1191.71Highdosegroup40.19±5.943)186.41±14.442)16.97±4.902)2466.26±766.692)

Note：1)P<0.01 vs control group;2)P<0.05,3)P<0.01 vs model group.

图3 FNS007对CIA大鼠放射学改变的影响Fig.3 Effect of FNS007 on radiographic changes of paws in CIA rats

表3FNS007对CIA大鼠放射学评分和组织病理学评分的影响

Tab.3EffectsofFNS007onradiologicscoresandhistopathologyscoresofCIArats

GroupsDosage(mg/kg)RadiologicscoresHistopathologyscoresControlgroup-0.00±0.000.00±0.00Modelgroup-6.54±2.581)3.33±0.651)Methotrexategroup0.503.92±1.782)2.50±0.802)Lowdosegroup0.254.67±2.772.33±0.783)Middledosegroup0.504.33±3.222.00±0.953)Highdosegroup1.002.92±2.983)1.83±0.583)

Note：1)P<0.01 vs control group;2)P<0.05,3)P<0.01 vs model group.

2.7FNS007对CIA大鼠组织病理学损伤的影响 病理结果显示，空白对照组大鼠踝关节结构完整，关节面软骨细胞排列整齐。模型组大鼠踝关节存在明显的滑膜纤维组织增生，血管翳形成及炎性细胞浸润，滑膜组织伸入关节腔内，导致关节腔狭窄乃至闭塞；关节面软骨大部乃至全部破坏，骨小梁结构排列紊乱。多数大鼠关节腔严重粘连甚至消失。FNS007各给药组大鼠踝关节结构损伤程度均较模型组呈剂量依赖性不同程度明显减轻，仅见少量滑膜组织增生及少量炎性细胞浸润，未见关节腔闭锁，关节强直(图4)。

图4 FNS007对CIA大鼠踝关节组织病理形态学的影响(HE，×200)Fig.4 Effect of FNS007 on ankle joint histopathologic examination (HE，×200)

病理评分结果如表3所示：与空白组比较，模型组大鼠的组织病理评分明显升高(P<0.01)。与模型组比较， FNS007各给药组组织病理评分与模型组相比均明显降低(P<0.01)。

3 讨论

RA是一种以慢性、多发性和对称性关节炎为临床特征的自身免疫疾病。其重要病理改变为关节滑膜组织增生，软骨和骨组织被破坏，造成关节功能障碍。从免疫角度而言，胶原性关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA) 模型更接近人类RA的发病机制，是目前研究RA的理想模型[6,7]。本文以Ⅱ型胶原免疫大鼠诱导CIA模型，动物表现为关节肿胀，关节及周围组织炎性细胞浸润,滑膜组织增生,关节结构破坏，血清TNF-α、IFN-γ、IL-6及抗CⅡ抗体水平升高，提示CIA模型制备成功。

研究表明，Th1及其分泌的细胞因子过量在RA发病机制中起着重要作用[8,9]，细胞因子网络和细胞因子失衡在自身免疫性疾病中发挥着重要作用。RA发病过程中细胞免疫亢进，Th1细胞介导分泌TNF-α、IL-1β和IFN-γ大量增多，TNF-α和IL-6是类风湿关节炎致病过程中的两个重要细胞因子，在激活滑膜细胞引起关节受损及诱导炎症过程中起重要作用，TNF-α可诱导滑膜细胞产生炎症介质，刺激滑膜细胞与软骨细胞合成胶原酶，引起并增强炎症反应。同时TNF-α的大量产生可以促进破骨细胞的生成，在RA的发病中起作用[10,11]。IL-6大量存在于RA患者的血清和关节液中,其浓度与RA的严重程度有关。IL-6能促进T细胞和B细胞的增殖和活化，促进类风湿因子和其他细胞因子产生，调节急性期反应蛋白的表达[12]。促炎性Th1细胞及其分泌的特征性细胞因子IFN-γ和抗炎性Th2细胞及其分泌的细胞因子的失衡是RA发病的重要机制。IFN-γ与单核细胞激活相关，可诱发组织损伤和炎症反应，导致软骨降解，促进滑膜成纤维细胞增殖。本研究观察了FNS007对CIA大鼠血清中炎性细胞因子的影响，结果显示，FNS007有效抑制CIA大鼠体内TNF-α、IFN-γ和IL-6的分泌，从而抑制了细胞因子的促炎效应,说明FNS007可能通过抑制Th1优势应答而达到治疗效果。约60%RA患者的血清中存在着抗CⅡ抗体,抗CⅡ抗体不仅是致病因素，也是疾病发展的生物标志物，在RA发病中起着重要作用。本研究显示FNS007明显降低CIA大鼠血清抗CⅡ抗体的产生。FNS007的治疗性给药有效调节了异常免疫反应并减少所产生的炎症介质，减轻CIA大鼠的炎症症状、抑制踝关节肿胀、软组织损伤及后期骨破坏，对大鼠CIA具有明显的治疗效果。

目前治疗RA的药物共分为五代：第一代是非甾体类抗炎药物；第二代是糖皮质激素；第三代是改变病情药(慢作用抗风湿药)；第四代是以TNF-α抑制剂为主的早期生物制剂；第五代为直接针对T细胞发生作用的新型生物制剂。FNS007是针对T细胞功能的生物制剂。抗原激活T细胞需要两种信号，第一信号为T淋巴细胞与抗原提呈细胞之间的作用；即TCR-Ag-HLA-DR三分子复合物的形成,细胞表面协同刺激分子提供第二信号。FNS007将CⅡ肽中与T细胞受体结合的氨基酸替换，保留与HLA-DRB1结合的氨基酸，可竞争性结合抗原提呈细胞表面的HLA-DRB1，抑制自身抗原与之结合，从而抑制TCR-Ag-HLADR三分子复合物的形成，从而抑制由HLA-DRB1介导的T细胞激活及自身免疫反应以及由此引起的炎症介质释放等病理过程。

综上所述，新型生物制剂FNS007对CⅡ诱导的大鼠胶原性关节炎有明显抑制作用，其机制为FNS007作用于CIA发病的起始环节，抑制T细胞活化，从而抑制抗体和致炎性细胞因子的分泌，减轻组织损伤和骨破坏，对关节炎起到治疗作用，这为该药应用于临床治疗类风湿关节炎及其他T细胞介导的自身免疫病提供了实验依据。

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[收稿2017-03-27]

(编辑 倪 鹏)

Effectsofnon-Tcellbindingpeptide(FNS007)oncollagenⅡ-inducedarthritisratmodels

LILi-Ping，LIUChao，XIELi-Jun，HUANGLi-Jing，HAONa，GELan，YANShao-Feng，LIGuo-Feng，XUXiao-Hong，ZHANGQin-Zeng，LILan-Fang，JIANGHong，ZHANGJian-Xin.

InstituteofMateriaMedical,HebeiCentersforDiseaseControlandPrevention,Shijiazhuang050021,China

Objective:To observe the effects of FNS007 on collagen Ⅱ- induced arthritis(CIA) rat models and investigate the underlying mechanism.Methods: CIA model was induced by intradermal injection of Freunds adjuvant and bovine CⅡ.Rats were randomly divided into six groups:normal control group,model group,methotrexate group,high,middle and low doses of FNS007 groups,with 12 rats in each group.FNS007 was gived by intravenous injection,the normal control and model group were administrated with PBS.Observing the paw thickness,ankle joint width and the arthritis scores in the CIA rats during the experiment.On d 22 after injection of the drug， all rats were killed.Interferon-γ(IFN-γ),tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-6 (IL-6) and level of anti-CⅡantibody in serum were examined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The pathological score and radiography of ankle joint were evaluated.Results: Data revealed that FNS007 treated groups showed a significant reduction in paw thickness,ankle joint width and the arthritis scores compared to model group (P<0.05,P<0.01),especially FNS007 high dose goup.The levels of TNF-α,IFN-γ,IL-6 and anti-CⅡantibodies in serum in high dose goup were significantly lower than those of model group(P<0.05,P<0.01).X-ray examination showed that FNS007 could significantly alleviate the damage of joint and decrease the radiographic scores.Pathological examination exhibited that FNS007 could significantly reduce pathological scores,alleviate inflammatory cell infiltration and synovial hyperplasia,improve the histopathological changes.Conclusion: FNS007 has a treating effect on CIA rats,and the mechanisms may be through competitive inhibition of T cell,inhibiting inflammatory cytokines and anti-CⅡantibodies secretion,regulating the abnormal immune responses.

Non-T cell binding peptide(FNS007); Collagen-induced arthritis;Rheumatoid arthritis；Rat

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.022

①本文为河北省重大医学科研课题资助项目(No.zd2013069)和河北省科技支撑计划项目(No.14272608D)。

李立萍(1975年-)，女，博士，副研究员，主要从事心脑肺血管和抗炎免疫药理学方面研究，E-mail:lilip2006@163.com。

及指导教师：张建新(1952年-)，男，博士,教授,博士生导师,主要从事心脑肺血管和抗炎免疫药理学方面研究,E-mail:zhangjx100@163.com。

R392

A

1000-484X(2017)09-1381-05

②河北菲尼斯生物技术有限公司，石家庄050035。