养肝解毒散结中药对肝癌血管生成作用及机制*

胡 兵安红梅王双双郑佳露闫 霞黄晓伟

1.上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科（上海，200032） 2.上海市中医药研究院中医肿瘤研究所 3.上海中医药大学附属龙华医院科技处

养肝解毒散结中药对肝癌血管生成作用及机制*

胡 兵1，2安红梅3王双双1，2郑佳露1，2闫 霞1，2黄晓伟1，2

1.上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科（上海，200032） 2.上海市中医药研究院中医肿瘤研究所 3.上海中医药大学附属龙华医院科技处

目的：观察养肝解毒散结（YGJDSJ）中药对肝癌血管生成的作用。方法：裸小鼠皮下移植人肝癌Bel-7402细胞，随机分为两组，每组10只，分别给予蒸馏水或YGJDSJ灌胃，1次/d，治疗3周后，剥离肿瘤组织，免疫组织化学法检测血管生成及相关基因表达。结果：YGJDSJ中药可以抑制Bel-7402人肝癌组织血管生成，与对照组比较差异有显著性意义（P＜0.01）；YGJDSJ中药可降低肝癌组织血管内皮生长因子（VEGF）和乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达，与对照组比较差异有显著性意义（P＜0.01）；YGJDSJ中药还可降低M2型肿瘤相关巨噬细胞在肝癌组织的分布，与对照组比较差异有显著性意义（P＜0.01）。结论：YGJDSJ中药可以抑制肝癌血管生成，其机制与下调VEGF、HIF-1α和M2型肿瘤相关巨噬细胞相关。

肝癌；养肝解毒散结中药；血管生成；血管内皮生长因子；乏氧诱导因子-1a；M2型肿瘤相关巨噬细胞

中医药是我国重要的生物医药资源，在肝癌的治疗中发挥了积极的作用［1］。养肝解毒散结中药复方（专利号：ZL201110145109.0）是项目组治疗肝癌临床验方，由女贞子、炙鳖甲、龙葵、蛇莓、泽漆、猫爪草、郁金、虎杖等中药组成；其中女贞子所含熊果酸可以抑制肝癌VEGF表达和血管生成［2］，龙葵、蛇莓、郁金可以抑制鸡胚尿囊膜血管生成［3～5］，虎杖单体白藜芦醇和大黄素可以抑制肿瘤血管生成［6，7］，提示养肝解毒散结中药复方可能具有抑制血管生成的作用。本实验研究拟观察养肝解毒散结中药对肝癌血管生成的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞株 BALB/C裸小鼠20只，6周龄，雌性，体重18～23g，购自上海斯莱克实验动物公司，实验动物许可证：SCXK（沪）2012－0002，饲养于龙华医院SPF级动物实验室。人肝癌Bel-7402细胞购自中国科学院细胞库。

1.2 主要仪器及试剂 培养箱，美国NuAire公司产品；低温离心机，美国Thermo公司产品；倒置显微镜，日本NIKON公司产品。DMEM、胎牛血清购自Hyclone公司。中药由龙华医院中药房提供并鉴定。CD31、血管内皮生长因子（VEGF）、乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）、精氨酸酶/（Arg-1）抗体购自Santa Cruz生物技术公司。其余为国产分析纯试剂。

1.3 中药制备 养肝解毒散结（YGJDSJ）中药由女贞子12 g，炙鳖甲30g，龙葵、蛇莓、泽漆、猫爪草、郁金、虎杖各15g等组成，按比例配方，加8倍量的水，浸渍1 h；炙鳖甲武火煮沸后文火煎煮0.5 h，加入其他中药煮沸后文火煎煮0.5 h，滤过；滤渣再加6倍量的水煎煮0.5 h，滤过；合并滤液，浓缩至2 g/ml，4℃储存备用。

图1 中药对肝癌血管生成影响图(HE,×200)

图3 中药对肝癌组织HIF-1α表达影响图(HE,×200)

图2 中药对肝癌组织VEGF表达影响图(HE,×200)

图4 中药对肝癌组织相关巨噬细胞影响图(HE,×200)

1.4 动物模型制备及分组 常规培养Bel-7402细胞，消化并计数，用PBS调整细胞浓度至5×107个/ml，每只裸小鼠给予无菌皮下注射0.1 m l细胞悬液；待肿瘤生长至可测量范围后随机分为对照组和YGJDSJ组，分别给予蒸馏水和YGJDSJ中药灌胃，0.3 ml/次，1次/d；两组动物均给予饲料，自由饮用无菌水。治疗3周后处死小鼠，保留肿瘤标本备用。

1.5 免疫组织化学检测 肿瘤组织常规固定、石蜡包埋、切片、脱蜡，3%H2O2封闭10min，PBS冲洗；柠檬酸缓冲液中（pH6.0）煮沸修复抗原，PBS洗涤；3%H2O2抑制内源性过氧化物酶，PBS洗涤；正常动物血清孵育5min，PBS洗涤；加入CD31、VEGF、HIF-1α、Arg-I（浓度1∶100）4℃过夜，PBS冲洗；加入对应二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，常规封片；Image Pro软件分析蛋白表达平均光密度值（MOD），结果以对照组倍数表示。

1.6 统计学方法 使用SPSS 18.0进行统计，计量资料以±s表示，两组之间比较采用t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠肝癌组织血管生成性况 采用CD31作为新生血管标志，免疫组化检测新生血管生成情况，结果显示对照组小鼠肝癌组织有较多新生血管生成，YGJDSJ中药可以抑制肝癌血管生成，与对照组比较差异显著（P＜0.01）。见表1及插页图。

表1 两组小鼠肝癌组织血管生成平均光密度比较（±s）

表1 两组小鼠肝癌组织血管生成平均光密度比较（±s）

与对照组比较，**P＜0.01

组别 n血管生成（MOD）1.00±0.07 YGJDSJ组 3 0.43±0.04对照组3 **

2.2 两组小鼠肝癌组织VECF表达情况 免疫组化检测结果显示，对照组小鼠肝癌组织VEGF表达明显，YGJDSJ中药可以抑制肝癌组织VEGF表达，与对照组比较差异显著（P＜0.01）。见表2及插页图1。

表2 两组小鼠肝癌组织VEGF表达平均光密度值比较（±s）

表2 两组小鼠肝癌组织VEGF表达平均光密度值比较（±s）

与对照组比较，**P＜0.01

组别 n VEGF（MOD）1.00±0.06 YGJDSJ组 3 0.34±0.03对照组3 **

2.3 两组小鼠组肝癌组织HIF-1α表达情况 免疫组化检测结果显示对照组小鼠肝癌组织有较多HIF-1α表达，YGJDSJ中药可以抑制肝癌组织HIF-1α表达，与对照组比较差异显著（P＜0.01）。见表3及插页图3。

表3 两组小鼠肝癌组织HIF-1α表达平均光密度值比较（±s）

表3 两组小鼠肝癌组织HIF-1α表达平均光密度值比较（±s）

与对照组比较，**P＜0.01

组别 n HIF-1α（MOD）对照组3 ** 1.00±0.05 YGJDSJ组 3 0.25±0.03

2.4 两组小鼠肝癌组织肿瘤相关巨噬细胞分布情况 采用Arg-I作为M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMS）标志，免疫组化检测M2TAMS在肝癌组织的分布，结果显示对照组肝癌小鼠组织有较多M2TAMS分布，YGJDSJ中药治疗后肝癌组织M2TAMS分布显著减少，与对照组比较差异显著（P＜0.01）。见插页图4，表4。

表4 两组小鼠肝癌组织肿瘤相关巨噬细胞分布平均光密度值比较（±s）

表4 两组小鼠肝癌组织肿瘤相关巨噬细胞分布平均光密度值比较（±s）

与对照组比较，**P＜0.01

组别 n TAM（MOD）1.00±0.04 YGJDSJ组 3 0.31±0.03对照组3 **

3 讨论

根据临床表现，肝癌可以归属于中医“鼓胀”、“黄疸”、“积聚”、“胁痛”、“肝积”、“肥气”、“伏梁”等范畴。历代医家对相关病证有一定阐发，如《灵枢·邪气脏腑病形篇》记载“肝脉微急为肥气，在胁下，若覆杯”，“伏梁，在心下”。《难经·五十五难·五脏攸分》记载＂肝之积名曰肥气，在左胁下如覆杯＂，《济生方·癓瘕积聚门》描述“肥气之状，在左胁下，覆大如杯，肥大而似有头足，是为肝积”。

肝癌临床表现复杂，涉及多个病理因素，属正虚邪实之证，正虚是肝癌发病的内因；现代中医发展了癌毒的概念，癌毒是肝癌发生发展的病理基础，抗癌是治疗肝癌的重要法则，可以认为虚、毒、瘀是肝癌的基本病机［1，8］。养肝解毒散结方由多味中药组成，其中女贞子、炙鳖甲滋阴养肝、散结；龙葵、蛇莓解毒散结；泽漆、猫爪草化痰散结；郁金、虎杖化瘀散结；诸药合用，共奏养肝解毒散结之功。

肿瘤组织由于生长失控、血管紊乱，肿瘤内部氧水平降低，促使肿瘤细胞通过无氧酵解、肿瘤血管生成等方式以适应乏氧环境；在乏氧条件下HIF-1α蛋白水平升高，HIF-1α可直接结合VEGF启动子，上调VEGF表达，促肿瘤血管生成［9］。本研究结果显示，养肝解毒散结中药可以抑制肝癌组织血管生成，同时伴随VEGF和HIF-1α表达降低，提示养肝解毒散结中药对肝癌血管生成抑制作用与下调VEGF和HIF-1α表达相关。

M2型TAMS是介导肿瘤炎症（Cancer-related inflammation）的主要细胞群体，低表达IL-12、IL-23，高表达IL-10和Arg-I，Arg-1是M2 TAMS的标志基因［10］。肿瘤细胞可以分泌IL-10、CSF-1等细胞因子，促使单核细胞分化为M2 TAMS。此外，肿瘤组织因乏氧高表达的HIF-1α也可以上调CXCL8和CXCR4促M2 TAMS分化。M2 TAMS可以抑制抗肿瘤免疫，促肿瘤转移，也可以通过分泌VEGF促肿瘤血管生成。本研究结果显示，养肝解毒散结中药治疗后肝癌组织M2 TAMS分布减少。

综上所述，本研究结果显示：养肝解毒散结中药可以抑制肝癌血管生成，其机制与下调VEGF、HIF-1α和M2型肿瘤相关巨噬细胞相关，值得进一步深入研究。

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［4]许扬，潘瑞乐，常琪，等.蛇莓抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管新生作用研究［J］.中药药理与临床，2008，24（3）：65-67.

［5]肖渊，李娜，李海芳，等.观察12种活血祛瘀类中药对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生成的影响［J］.药物分析杂志，2009，29（7）：1079-1082.

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Effects and M echanism of YangGan JieDu SanJie Herbs on Angiogenesis in Hepatocellular Carcinoma*

HU Bing1，2AN Hong-Mei3，WANGShuang－Shuang1，2，etal.1.Departmentof Oncology，Longhua Hospital，ShanghaiUniversity of Traditional Chinese Medicine（Shanghai，200032）China

Objective：To observe the effects of YangGan JieDu SanJie herbs（YGJDSJ）on angiogenesis in human hepatocellular carcinoma.Methods：Nudemice subcutaneously transplanted with Bel－7402 human hepatocarcinoma cellswere random ly divided into two groups（10mice per group），and intragastric administered with distilled water or YGJDSJdaily.After threeweeks of treatment，the tumorswere dissected.Gene expression was detected by IHC（Immunohistochemistry）.Results：compared with control group，YGJDSJ could significantly inhibitangiogenesis and down－regulated VEGF（Vascular endothelialgrowth factor）and HIF-1α（Hypoxia Inducible Factor-1α）expression in Bel-7402 hepatocarcinoma（P＜0.01）.At the same time，YGJDSJalso could significantly decrease distribution of TAMs（Tumor－associated macrophages）in Bel－7402 hepatocarcinoma（P＜0.01）.Conclusion：YGJDSJ can inhibit angiogenesis in hepatocarcinoma and may relate to down-egulation of VEGF，HIF-1αand TAMs.

Hepatocellular carcinoma；angiogenesis；YangGan JieDu SangJie；VEGF；HIF－1α；Tumor－associated macrophages

2016－10－26 编辑：程良斌）

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.03.012

国家自然科学基金（No.81473625）；上海市中医药事业发展三年行动计划（No.ZY3-CCCX-3-3025）；上海市科技支撑项目（No.16401902500）