3株果实采后葡萄孢属真菌ITS区rDNA序列与碳源代谢指纹图谱分析

姚 婷， 陈其葳， 张 燕， 张 萌， 何欣萌， 王友升

(北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心/食品质量与安全北京实验室， 北京 100048)

3株果实采后葡萄孢属真菌ITS区rDNA序列与碳源代谢指纹图谱分析

姚 婷， 陈其葳， 张 燕， 张 萌， 何欣萌， 王友升*

(北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心/食品质量与安全北京实验室， 北京 100048)

从采后贮藏过程中发病的草莓、蓝莓和樱桃果实中分离到3株丝状真菌138#、233#和366#。综合形态学特征观察与ITS区rDNA序列分析结果，可确定3株真菌均为葡萄孢属病原菌(Botrytis)。分子鉴定进化树和碳源代谢聚类分析结果，都得到菌株138#与366#在一个大的分支上，而菌株233#在一个分支上。菌株138#鉴定结果与Botrytiscinerea(KJ937044.1)在同一分支上亲缘性达100%，且与366#亲缘性达99%；菌株233#鉴定结果与Botrytiselliptica(EU519207.1) 在同一分支上且亲缘性达100%。95种碳源代谢指纹图谱分析的结果表明，3株葡萄孢属病原菌对吐温80、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-D-葡萄糖胺和苦杏仁苷等67种碳源的代谢能力相同，包括56种最适碳源、1种可利用碳源和10种不可利用碳源，Biolog系统中鉴定出3株丝状真菌均与B.cinereaPers.BGA相近，其中菌株233#与B.cinerea的代谢指纹图谱最为相近。

果实； 葡萄孢菌； ITS区rDNA序列分析； 碳源代谢指纹图谱

葡萄孢属真菌是果蔬采后贮藏期间常见的侵染性病原菌，是分布广泛的兼性寄生菌，有性态为富氏葡萄核盘菌(Botryotiniafuckeliana)[1-2]。目前报道最多的灰葡萄孢菌(B.cinerea)属半知菌亚门丝胞纲丝胞目淡色孢科葡萄孢属真菌，能引起蓝莓、番茄、葡萄和草莓等果蔬的采后病害[3-5]；而葱腐葡萄孢菌(B.allii)和蒜葱鳞葡萄孢霉(B.squamosa)能引起蒜薹 “烂窝病”[6]。此外，也有关于蚕豆葡萄孢(B.fabae)和拟蚕豆葡萄孢(B.fabiopsis)能引起蚕豆赤斑病的报道[7]。但该属其他病原菌引起的病害报道较少，而且不同寄主来源的葡萄孢属病原菌属内种间的亲缘关系尤其对碳源利用的差异性，还需进一步阐明。

利用不同物种间的ITS区rDNA序列构建进化树，可确定微生物属内种间的亲缘关系[8-10]。利用不同物种对碳源的适应性不同，FF鉴定板上培养的霉菌在Biolog微生物自动分析系统中可得到目的菌株对不同碳源的利用情况，获得该菌种的碳源代谢指纹图谱[11-13]。前期利用ITS区rDNA序列和碳源代谢指纹图谱分析对桃、李果实采后褐腐病菌的亲缘关系进行区分的结果表明，2种方法具有可比性[14]。但目前未见利用ITS区rDNA序列和碳源代谢指纹图谱分析对于果实采后葡萄孢属病原菌之间亲缘关系的报道。

本研究从采后贮藏期间发病的草莓、蓝莓和樱桃果实中分离到3株丝状葡萄孢属(Botrytis)病原真菌，结合形态学观察和真菌ITS 区rDNA序列分析，并比较分析碳源代谢指纹聚类和分子鉴定系统发育树结果，以期为不同果实采后灰霉病菌的营养生理研究、病害防治及真菌种间关系研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株

丝状病原真菌138#、233#和366#分别分离于采后贮藏过程中自然发病草莓、蓝莓和樱桃果实。

1.1.2培养基

马铃薯培养基(PDA)：取200 g马铃薯切片加1 L蒸馏水，煮沸30 min后的滤汁，加入琼脂18 g、葡萄糖20 g、加水补足1 L，121 ℃灭菌20 min。麦芽浸粉培养基(ME)：琼脂18 g、麦芽浸粉20 g，调节pH值至5.5±0.2，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3试剂与仪器设备

三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸钠(SDS) 、乙二胺四乙酸钠(EDTA) 购自Amersco公司。Invitrogen公司合成PCR引物ITS-4和ITS-5、天根生化试剂公司DNA分子质量标准2×Taq PCR MasterMix。FF MICRO PLATE，美国Biolog公司。

Axio Image A1型显微镜，德国Zeiss公司；生物安全柜，美国Thermo公司；微生物鉴定系统，美国

Biolog公司；PCR仪，美国Bio-RAD公司。

1.2 实验方法

1.2.1菌种的分离、纯化与回接

取发病的草莓、蓝莓和樱桃果实发病与未发病交界处组织于PDA上，25 ℃培养1～3 d。取菌落外缘菌块，分别3点转接到PDA和ME上，25 ℃培养7,14 d后观察菌落形态和孢子形态特征。以75%乙醇对健康无损伤的草莓、蓝莓和樱桃果实表面消毒后刺伤，伤口处接种纯化后的菌块，观察果实接种处的病症。

1.2.2基因组DNA的提取及ITS区PCR扩增与序列测定

采用改良后SDS-氯化苄法提取待鉴定菌株的DNA[9]。以ITS-4和ITS-5为引物，通过PCR扩增出ITS区，PCR产物由华大基因测序，结果在NCBI同源序列比对，在StrainInfo中搜索模式菌株，将3株分离菌ITS区rDNA序列与同源序列和模式菌株序列进行系统发育分析，并且构建系统发育进化树。

1.2.3碳源代谢指纹图谱分析

用棉签收集26 ℃下PDA培养基平板上培养120 h后的3株病原菌的孢子，用FF-IF浊度标准液制备T(透光率)=(75+2)%的菌悬液。在FF微孔板中每孔加100 μL菌悬液，26 ℃培养7 d后，用Biolog微生物自动分析系统读取96孔FF板鉴定结果，获得病原菌的代谢指纹图谱，FF板的碳源分布如表1。

表1 FF板的碳源分布

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与回接

分别从自然发病的“双流冬”草莓、“兔眼”蓝莓和“水晶”樱桃果实发病部位分离到丝状真菌138#、233#和366#，见图1a、1b、1c。将分离得到菌株纯化后回接到草莓、蓝莓和樱桃果实伤口处，在接种部位均出现病症(见图1d、1e、1f)，并能从该病害部位再次分离得到相应病原菌，因此，可确定它们均为相应果实的病原菌。

2.2 病原菌的形态观察

2.2.1菌落形态

将3株真菌138#、233#和366#在PDA和ME上25 ℃培养7 d和14 d，观察菌落特征，见图2。

图1 3株病原真菌在不同果实上分离与回接时的病症Fig.1 Symptoms of isolated fruits and reinululated fruits of three fungal pathogens

图2 3株病原菌在PDA和ME培养基25 ℃培养7 d和14 d的菌落特征Fig.2 Colony growth of three isolated strains cultured on ME and PDA plates for 7 d and 14 d at 25 ℃

由图2的菌落形态表明，3株菌在PDA和ME上25 ℃培养条件下均生长旺盛、外观干燥、不透明、呈绒毛状，菌丝渗透在培养基表面浅层，有色素产生。菌株138#的菌落质地松散、呈棕色，PDA培养的菌丝更旺盛但颜色较浅；培养7 d后，在PDA培养的菌落直径较大，而ME培养的菌落呈现明显的圆形轮纹(图2a、2d)；继续培养至14 d时，菌落向培养基周围的均匀伸展，后期菌落整体呈现灰绿色且有球状物，以PDA上球状物偏多(图2g、2j)。类似的，菌株233#的菌落质地松散，培养7d在ME上呈灰绿色，而在PDA上呈浅棕色(图2b、2e)；继续培养至14 d，菌落表面出现球状突起，以PDA培养基上球状物偏多且菌落由浅棕色变为灰白色，而ME板则由灰绿色变成黄绿色(图2h、2j)。相比而言，培养7 d后，菌株366#在两种培养基上的菌落均质地紧密且菌丝较短、呈棕色，但ME上的菌落颜色较浅(图2c、2f)；培养14 d后，两种培养基上的菌丝颜色均加深(图2i、2l)。

2.2.2显微形态

使用显微镜观察3株丝状真菌138#、233#和366#的形态，见图3。

图3 3株病原菌的显微形态Fig.3 Morphological characteristics of three fungal pathogens

由图3可知，3株病原菌的显微形态基本一致，菌丝呈细长隔膜状，菌丝分枝较多且内部隔膜观察清晰，成熟菌丝顶端长有分生孢子，分生孢子梗紧密聚集成簇，上生葡萄状分生孢子，卵圆形或球形，单孢。

2.3 基因组DNA PCR扩增

图4为3株病原菌ITS区产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测的结果。由图4可以看出DNA片段大小约600 bp，与实验设计的结果一致。

2.4 构建ITS区rDNA系统进化树

将3株灰葡萄孢属真菌的ITS区rDNA基因PCR扩增片段的序列在NCBI上比对得到同源序列，利用MEGA6软件构建的系统进化树如图5，3株病原真菌中，菌株138#鉴定为Botrytiscinerea(KJ937044.1)，亲缘性达100%，而且与菌株366#在一个大分支上，亲缘性达99%；而菌株233#鉴定为Botrytiselliptica(EU519207.1)，亲缘性达100%。

图4 3株病原真菌的ITS区rDNA电泳检测图谱Fig.4 Agarose gel electrophoresis results of ITS rDNA sequence of three strains

图5 3株以ITS rDNA基因序列为分子标记的灰葡萄孢菌菌株的系统进化树Fig.5 Positions of three fungi strains based on ITS rDNA sequence in phylogenetic tree

2.5 碳源代谢指纹图谱分析

将3株真菌138#、233#和366#在FF板上进行碳源代谢测试，与对照菌种BotrytiscinereaPers.BGA对比，结果见表2。

由表2可以看出，3株菌对95种碳源的适应性很强，能利用的碳源均达75种以上，不同菌株之间的碳源代谢指纹图谱存在一定差异。3株菌共有67种碳源利用程度相同，包括吐温80、N-乙酰-D-葡萄糖胺、苦杏仁苷、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖醇、D-纤维二糖、α-环式糊精、β-环式糊精、糊精、D-果糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、龙胆二糖、α-D-葡萄糖、α-D-葡萄糖-1-磷酸、D-葡萄糖醛酸、丙三醇、肝糖、2-酮-D-葡糖酸、α-D-乳糖、乳果糖、麦芽糖醇、麦芽糖、麦芽三糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-松三糖、D-蜜二糖、β-甲基-D-半乳糖苷、β-甲基-D-葡萄糖苷、异麦芽酮糖、D-蜜三糖、L-鼠李糖、水杨苷、水苏糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、D-木糖、γ-氨基丁酸、溴代丁二酸、反丁烯二酸、D-苹果酸、奎宁酸、癸二酸、琥珀酸、琥珀酸单甲酯、L-丙胺酰胺、L-丙氨酰-甘氨酸、L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-鸟氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和腺苷等56种最适碳源，N-乙酰-D-半乳糖胺、i-赤藓糖醇、葡糖醛酰胺、m-肌醇、β-羟丁酸、γ-羟丁酸、D-乳酸甲酯、L-乳酸、N-乙酰-L谷氨酸和5′-磷酸腺苷等10种不可利用碳源，以及1种可利用碳源p-羟基苯乙酸。其中，与Biolog数据库中BotrytiscinereaPers.BGA的代谢指纹图谱最相近的是菌株233#，两者仅对熊果苷的利用程度差异较大；其次是菌株138#，利用程度差异较大的碳源仅有D-葡萄糖胺和尿苷；而与菌株366#利用情况相同的碳源仅有51种。

聚类分析可将具有相似碳源代谢特征的菌进行分类，从而有效反映不同菌株在代谢上的关系。对3株分离到的灰霉病菌，采用欧氏距离测量，2样本间用Average Linkage法联结，以95种碳源的利用情况作为聚类变量，进行聚类分组，结果如图6，通过系统聚类分析可将3株病原真菌直观清楚的区分开来，其中菌株366#与138#首先聚为一类，其次是菌株233#，最后与数据库中的B.cinereaPers. BGA聚类在一起。

表2 3株灰霉菌的碳源代谢指纹图谱

++表示最适碳源，+表示可利用碳源，-表示不可利用碳源；对照菌株为BotrytiscinereaPers.BGA。

图6 3 株灰葡萄孢属真菌碳源代谢指纹图谱的聚类分析Fig.6 Clustering drawing of three isolated Botrytis strains by gresemblance of metabolic fingerprinting

3 讨 论

本研究的结果表明，草莓138#和樱桃366#病原菌均鉴定为灰葡萄孢菌B.cinerea，据报道B.cinerea可引起蓝莓和草莓灰霉病[1,5]，但未见引起樱桃灰霉病的报道。类似地，本研究发现蓝莓233#为百合葡萄孢菌B.elliptica，引起蓝莓灰霉病的有B.cinerea、B.byssoidea、B.aclada、B.squamosa和B.fabae等[15]，但由百合葡萄孢菌B.elliptica引起的蓝莓病害未见报道。

此外，本研究对3株灰霉病菌ITS区序列的变异性分析发现，菌株138#和366#与B.cinerea在同一分枝，而菌株233#与B.elliptica在同一分枝上。碳源代谢指纹图谱的结果也表明，菌株138#和366#在同一分枝上，再与菌株233#聚为一类，最后与Biolog系统中的模式菌株B.cinereaPers. BGA聚类。虽然分子系统进化树分类与碳源代谢聚类分析对3株灰霉病菌种间分类一致，但菌株233#对碳源的利用情况与B.cinereaPers. BGA碳源代谢最相近，即属内不同种间对碳源的代谢具有可比性，同一物种对碳源的利用存在差异性。这可能由于它们的碳源代谢除受自身遗传限制外，还受菌体自身生长状况等环境条件影响。

对95种碳源的代谢指纹图谱表明，3株葡萄孢属病原菌可以利用的碳源都在75种以上，表明葡萄孢属病原菌对不同碳源的适应性较强，这可能是该属病原菌侵染范围广、难以进行有效生物防治的原因。因此，为研究拮抗酵母菌利用竞争营养与空间方式发挥生防效果来防治葡萄孢属真菌导致的病害，还需进一步深入挖掘对碳源代谢指纹图谱的特异性。

4 结 论

从采后贮藏期间自然发病的草莓、蓝莓和樱桃果实分离得到3株丝状真菌，结合形态学特征和ITS区rDNA序列分析，确定均为葡萄孢属真菌(Botrytisspp.)。对比ITS区rDNA序列进化树和碳源代谢聚类分析，3株葡萄孢属真菌分子鉴定和碳源代谢种间分类一致。对95种碳源代谢指纹图谱分析表明，3株葡萄孢属真菌均能利用75种以上碳源，其中菌株233#B.cinereaPers. BGA碳源代谢最相近。

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(责任编辑：李 宁)

AnalysisofrDNAITSandCarbonMetabolicFingerprintingofBotrytisNeesIsolatedfromThreeFruits

YAO Ting, CHEN Qiwei, ZHANG Yan, ZHANG Meng, HE Xinmeng, WANG Yousheng*

(BeijingAdvancedInnovationCenterforFoodNutritionandHumanHealth/BeijingLaboratoryforFoodQualityandSafety,BeijingTechnologyandBusinessUniversity,Beijing100048,China)

Three strains 138#，233#and 366#were isolated from infected strawberry, blueberry and cherry fruit. All the fungal pathogens were identified asBotrytisNees by morphological characterization and rDNA ITS analysis. The results obtained by the analysis of both morphological characterization and rDNA ITS sequence showed that strains 138#and 366#belonged to the same species and were closely related toB.cinerea(KJ937044.1). In contrast, strain 233#had a close phylogenetic relationship withB.elliptica(EU519207.1). The biolog microbial identification system with FF microplate was applied for 95 different carbon and nitrogen sources utilization tests of three pathogens, and the result of the carbon metabolic fingerprinting showed that three strains had 67 carbon sources in common, including fifty-six optimal carbon sources, one available carbon source and ten unavailable carbon sources. In addition, metabolic profiling revealed that three fungi were all closely related toB.cinereaPers. BGA and 233#was the nearest toB.cinereaPers. BGA.

fruit；BotrytisNees； rDNA ITS sequence analysis； carbon metabolic fingerprinting

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.04.007

2095-6002(2017)04-0049-07

姚婷， 陈其葳， 张燕， 等. 3株果实采后葡萄孢属真菌ITS区rDNA序列与碳源代谢指纹图谱分析[J]. 食品科学技术学报，2017,35(4):49-55. YAO Ting, CHEN Qiwei, ZHANG Yan, et al. Analysis of rDNA ITS and carbon metabolic fingerprinting of fourBotrytisNees isolated from three fruits[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(4):49-55.

2017-04-21

“十二五”国家科技支撑计划项目(2015BAD16B06)；国家自然科学基金资助项目(31471626)。

姚 婷，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术；

TS255.36; Q93-331

： A

*王友升，男，教授，主要从事果蔬绿色保鲜及其高值化方面的研究，通信作者。