菲律宾蛤仔黏附污泥絮凝机制研究

周海军，崔 霞，王玉霞，穆 军

（浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022）

菲律宾蛤仔黏附污泥絮凝机制研究

周海军，崔 霞，王玉霞，穆 军

（浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022）

菲律宾蛤仔粘附污泥作为天然絮凝剂具有良好的天然絮凝活性，为研究其絮凝活性产生机制，本文针对粘附污泥中的生物因素（细菌、真菌、无菌蛤仔）和非生物因素（泥沙）等生态组成，建立5组蛤仔暂养系统，分别投加细菌双抗生素、真菌双抗生素、细菌双抗生素和真菌双抗生素联用、不加栖息地泥沙、以及正常暂养对照（加栖息地泥沙），比较各生态因素对菲律宾蛤仔所产粘附污泥的絮凝沉淀性能的影响。结果表明，细菌是菲律宾蛤仔粘附污泥具备絮凝性能的关键生物因素，栖息地泥沙是促进粘附污泥絮凝的重要非生物因素；耐药絮凝活性细菌使得细菌双抗生素组的粘附污泥仍具备一定的絮凝活性；多糖是菲律宾蛤仔粘附污泥产生絮凝作用的重要物质基础。

菲律宾蛤仔黏附污泥；絮凝机制；微生物

絮凝剂在给水处理、污水净化、食品和发酵工程等领域有着极为广泛而关键的应用[1-2]。絮凝剂按分子组成可分为无机絮凝剂、有机合成高分子絮凝剂和天然高分子絮凝剂三大类[3-4]。在我们的前期研究中发现，菲律宾蛤仔粘附污泥作为一种新型的天然絮凝剂，具备絮凝、脱色、重金属去除等优良特性[5-7]。

菲律宾蛤仔粘附污泥是具有复杂生态关系的活性生物污泥，本研究目的在于阐明其絮凝活性产生机制。通过对菲律宾蛤仔暂养，采用抗生素投加选择性抑制细菌、真菌，以及在系统中投加和不加栖息地泥沙的方式，逐一确定其中的各个生态因素对菲律宾蛤仔所产粘附污泥是否产生絮凝活性所起的作用，从而揭示菲律宾蛤仔粘附污泥的絮凝活性的真正产生原因。迄今为止，这是首个关于菲律宾蛤仔粘附污泥絮凝活性机制的报道。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂

菲律宾蛤仔采集于浙江省舟山市普陀区朱家尖一处海水养殖场；方形养殖箱为200 L塑料水产养殖箱，74 cm×54 cm×58 cm，为方便换水，在每一个养殖箱距箱的底部以上10 cm处安装了球形阀放水开关；海泥采集于浙江舟山长峙岛滩涂，细粒海砂采集于浙江舟山朱家尖海滨浴场；食用级螺旋藻粉购于山东滨州尚嘉水族馆；灰黄霉素、青霉素钾、硫酸链霉素、5-氟胞嘧啶购于南京晶玛生物科技有限公司；高岭土、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白购于国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、浓硫酸、磷酸、苯酚和葡萄糖等均为国产分析纯试剂；精密pH试纸购于上海三爱思试剂有限公司。

使用的主要仪器：紫外可见分光光光度计（Agilent Cary 60，美国安捷伦公司）；涡旋振荡器（VG3S025型，IKA）；电子天平（LE204E型，上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；恒温定时搅拌器（JB-3A型，上海雷磁仪器仪表有限公司）。

1.2 实验仪器

1.2.1 菲律宾蛤仔暂养系统的建立

本实验的养殖系统设立于浙江省舟山市水产研究所的朱家尖养殖基地，采用专用气路曝气，专用过滤海水补换养殖水体。养殖箱设5组，编号A、B、C、D、E，每组做平行实验3个，共15个。A组为含有泥沙的原始对照组；B组为抑制细菌的实验组（加入终浓度为60 μg/mL青霉素和80 μg/mL链霉素）；C组为抑制真菌的实验组（加入终浓度15 μg/mL灰黄霉素和120 μg/mL的5-氟胞嘧啶）；D组为同时抑制细菌和真菌的实验组（加入终浓度 60 μg/mL 青霉素、80 μg/mL 链霉素、15 μg/mL 灰黄霉素、120 μg/mL 的 5-氟胞嘧啶）；E组为不含泥沙的对照组。

海泥和海砂取回后在太阳下暴晒一天除去泥中的有害病原微生物。晒好的海泥和海砂充分碾碎后按体积比3:7混合，搅拌均匀，将泥沙铺在A、B、C、D四组共12个养殖箱内，泥沙层厚度在3～4 cm，注入海水至箱的高度一半左右。E组不放泥沙作为空白组养殖。

精心挑选后蛤仔规格一般在（3±0.5）cm×（1.5±0.5）cm范围内，均匀散放到水箱内，每个水箱约放700～800 g蛤仔（90±5枚）。对于有泥沙的水箱，一般放入蛤仔后静置4～6 h后，蛤仔都钻入泥沙底质层，水质都会由浑浊状态变成清澈见底的状态。

日常管理维护包括每日早晚各喂食一次，每次每个水箱加入3～5 g的螺旋藻粉。每天换水1次，从水箱底部球阀放水，然后从上面缓缓加入20 L新鲜海水。换水时需注意检查水箱内的蛤仔是否有死亡情况，若有要及时挑拣出来以防败坏水质。

1.2.2 粘附污泥的采集

各暂养组别在养殖场暂养45 d后，取回鲜活菲律宾蛤仔分别置于500 mL烧杯中，加入自然海水暂养过夜。第二日捞出蛤仔，静置10 min后倾倒上层海水，仔细收集杯底的蛤仔粘附污泥，置于称量瓶中60℃恒温干燥。

1.2.3 絮凝活性测定

絮凝实验的测定参照文献[5，8]的方法并做适当改进：在93 mL的4 g/L高岭土悬浊液中加入2 mL样品溶液和5 mL CaCl2（1%，m/v），调节混合液pH值到7.5；160 r/min搅拌1 min，40 r/min搅拌2 min；静置10 min后，吸取液面以下1 cm处悬浊液，可见分光光度计于550 nm处测吸光度A；相同条件下用2 mL去离子水代替样品溶液测得吸光度A0；絮凝率（FR）的计算公式：

A0和A分别是对照组和样品溶液在550 nm处的吸光度。

1.2.4 多糖的测定

参照牛江涛等[9]、DUBOIS等[10]报道的苯酚-硫酸法并稍作修正：（1）配置40 μg/mL的葡萄糖标准溶液，分别吸取 0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 标准溶液并用蒸馏水补至 2.0 mL，加入 6%苯酚 1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，迅速摇匀，冷却后于490 nm测吸光度。以多糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作多糖含量的标准曲线。（2）将样品配制成2 mL样品溶液，按照标准曲线制作方法相应步骤测量样品的总糖含量。

1.2.5 蛋白质的测定

参照BRADFORD[11]报道的蛋白质含量的测量方法并稍作修改：（1）取具塞比色管6支，分别加入100 μg/mL 牛血清蛋白 BSA 标准溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，补加蒸馏水至 1.0 mL，得到含 BSA 0、20、40、60、80、100 μg的标准系列，分别加入5 mL考马斯亮蓝试液，振荡均匀，室温静置10 min后于595 nm处测吸光度。以BSA浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作蛋白质含量标准曲线。（2）将样品配置成1 mL样品溶液，按照标准曲线方法测量样品的蛋白含量。

1.2.6 耐药细菌的分离与絮凝活性测定

移取B组蛤仔粘附污泥样品1 mL到盛有9 mL无菌水试管中，制成10-1稀释度的粘附污泥悬浊液，依序进行10-2、10-3、10-4梯度稀释，将各梯度稀释液在加有抗生素的固体培养基上进行涂布分离，所用抗生素固体培养基成分为：葡萄糖20 g、硫酸铵0.2 g、尿素0.5 g、酵母膏0.5 g、硫酸镁0.2 g、磷酸二氢钾2.0 g、磷酸氢二钾5.0 g、青霉素 60 mg、链霉素80 mg、琼脂20 g、陈化海水1 L，pH为7.2～7.4。涂布分离培养平板于25°C培养7 d后，随机挑选单菌落在抗生素固体培养基上划线分离，25°C条件下培养7 d。

将分离纯化得到的耐药菌株分别接种到液体培养基中发酵培养，液体培养基成分为：葡萄糖20 g、硫酸铵0.2 g、尿素0.5 g、酵母膏0.5 g、硫酸镁0.2 g、磷酸二氢钾2.0 g、磷酸氢二钾5.0 g、陈化海水1 L，pH调节7.2～7.4，25 °C、180 r/min 条件下培养 5 d，培养后发酵液于 9 000×g、4 ℃离心 20 min 去除菌体，收集上清液，参照“1.2.3”进行絮凝活性测定。

2 结果与分析

2.1 不同处理后各组蛤仔粘附污泥絮凝活性

5组蛤仔粘附污泥絮凝活性结果见表2。根据表2，各个生态因素的作用机制分析如下：

蛤仔的作用分析：D组联合使用细菌双抗和真菌双抗，对暂养系统中的细菌和真菌进行了全面抑制，此时蛤仔正常存活但絮凝活性极低，说明蛤仔自身产生不了起絮凝作用的物质，其体内的细菌和真菌是使蛤仔粘附污泥形成絮凝活性的原因。

真菌的作用分析：C组使用真菌双抗抑制了系统中的真菌，粘附污泥中仅存活大量细菌的作用，其絮凝活性占原始对照组A组絮凝活性的85%，说明蛤仔粘附污泥中真菌对其形成絮凝活性作用贡献不大，细菌可能是最主要的活性产生者。

细菌的作用分析：B组使用细菌双抗抑制了细菌，理论上起絮凝作用的产絮微生物没有了，其絮凝活性应该几近丧失，但B组仍然保持着相对正常对照组A组64.86%的絮凝活性，推测是因为耐药细菌承担了部分絮凝作用，遂进行了耐药絮凝细菌的分离和活性分析予以证实，结果分析见“2.3”。

泥沙的作用分析：A、B、C、D四组均添加了栖息地泥沙，其粘附污泥絮凝活性明显强于未添加栖息地泥沙的E组的粘附污泥絮凝活性，说明泥沙是菲律宾蛤仔粘附污泥发挥良好絮凝活性的不可缺少的重要因素。泥沙是蛤仔粘附污泥的重要组成部分，与各种微生物及其产生的絮凝物资粘接在一起形成粘附污泥絮体，大大增加了粘附污泥絮体的密度，便于快速沉降。

表1 抗生素处理后的各组菲律宾蛤仔吐泥的絮凝活性测定Tab.1 Flocculation activity of R.philippinarum conglutination mud after treatments

2.2 不同处理组蛤仔粘附污泥的絮凝活性成分分析

不同处理组蛤仔粘附污泥的多糖和蛋白质含量见表2。

表2 抗生素处理后的各组菲律宾蛤仔吐泥的化学成分测定Tab.2 Sugar and protein contents of R.philippinarum conglutination mud after treatments

从各组的化学组成来看，每组的主要物质是多糖，蛋白质的含量极低，仅有A、C两组含有蛋白质，其占比分别为7.56%和5.93%。整体来看，各组的多糖含量和絮凝率之间呈正相关关系。由此可见多糖是粘附污泥产生絮凝作用的重要物质基础。

2.3 耐药絮凝细菌的分离和活性分析

对B组（抑制细菌实验组）的蛤仔黏附污泥样品中能耐受细菌双抗的絮凝剂产生细菌进行分离纯化，共获得50株同时对青霉素和链霉素具有抗性作用的耐药细菌。通过对菌株的发酵液分别进行的高岭土悬浊液絮凝试验，50株耐药细菌发酵液絮凝活性为30%以上。

B组产生耐药菌的事实带来了对D组未通过获得细菌耐药性而提升絮凝活性的再思考，在未有进一步的证据前暂且分析认为，这可能是在细菌和真菌的共同抑制作用下，尚且产生的耐药菌株胞外多糖的合成代谢路径发生了改变，具有絮凝活性的多糖产量的减少（表2）从而D组蛤仔粘附污泥的絮凝活性大大降低。

3 结论

通过对菲律宾蛤仔人工养殖系统添加抗生素（抑制细菌或真菌）和改变蛤仔栖息地因素（添加泥沙与否）与原始生态环境下的蛤仔暂养进行对照，研究其粘附污泥絮凝活性及活性成分组成得到如下结论：

（1）细菌是菲律宾蛤仔粘附污泥具备絮凝性能的关键生物因素，栖息地泥沙是促进粘附污泥絮凝的重要非生物因素，菲律宾蛤仔自身对粘附污泥絮凝活性无贡献，真菌作用亦不大。

（2）多糖是菲律宾蛤仔粘附污泥产生絮凝作用的重要物质基础，蛋白质含量相对多糖较少较难起到作用。

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[11]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical biochemistry,1976,72(1/2):248-254.

Study on the Flocculation Mechanism of Ruditapes philippinarum Conglutination Mud

ZHOU Hai-jun,CUI Xia,WANG Yu-xia,et al
(School of Marine Science and Technology of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

Ruditapes philippinarum conglutination mud had good flocculation capacity as a natural bioflocculant.To investigate the flocculation mechanism of conglutination mud,biological factors(including bacteria,fungi and clam itself)and abiotic factor(habitat sediment)were selected to determine their respective contribution to the flocculation performance of conglutination mud.Five aquaculture systems for R.philippinarum were established by selectively inhibiting bacteria,fungi and both of them using respective antibiotics combination,and habitat sandy mud was also taken as an addition choice.R.philippinarum conglutination mud were collected for flocculation activity analysis,drug Resistant Bacteria isolation and flocculation ingredients elucidation.Results showed that bacterium was the key biological factor that triggered the flocculation activity formation of R.philippinarum conglutination mud and habitat sediment was the important abiotic factor to fasten the precipitation of R.philippinarum conglutination mud flocs.Polysaccharide is the basic material for flocculation capacity of R.philippinarum conglutination mud.

Ruditapes philippinarum conglutination mud;flocculation mechanism;microorganism

X703.5

A

1008－830X(2017)03－0248－05

2017-01-10

国家自然科学基金项目（31470540）；舟山科技计划项目（2014C41018）

周海军（1989-），男，湖北蕲春人，研究方向：海洋环境污染防治.

穆军，教授.E-mail:mujun@zjou.edu.cn