鱿鱼蛋白抗氧化肽的稳定性及抗疲劳和抗癌活性

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(岭南师范学院化学化工学院,广东高校新材料工程技术开发中心,广东湛江 524048)

鱿鱼蛋白抗氧化肽的稳定性及抗疲劳和抗癌活性

胡小军,江敏*,王标诗,余炳生,苗碗根,冯凌凌

(岭南师范学院化学化工学院,广东高校新材料工程技术开发中心,广东湛江 524048)

以鱿鱼抗氧化肽清除DPPH自由基和羟自由基的活性变化为指标,研究了温度、pH、金属离子、防腐剂和食品配料对鱿鱼抗氧化肽的抗氧化稳定性的影响,同时对鱿鱼抗氧化肽的抗疲劳和抗癌活性进行了初步研究。实验结果表明:鱿鱼抗氧化肽具有较强的耐热性,加热到100 ℃,仍能保持94%以上的活性;在酸性环境中活性保持较好,在碱性条件下活性丧失较快;蔗糖、NaCl对鱿鱼抗氧化肽的稳定性影响不明显,而葡萄糖和苯甲酸钠会明显降低鱿鱼抗氧化肽活性(p<0.05);Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+金属离子对鱿鱼抗氧化肽稳定性均有不同程度的影响,影响顺序为:Cu2+>Zn2+>Mg2+>Ca2+。鱿鱼抗氧化肽有较好的抗疲劳活性,与空白相比,抗氧化肽可以延长小鼠力竭游泳时间达到23%～36%。鱿鱼抗氧化肽对胃癌细胞SGC-7901的增殖有明显的抑制作用,半数抑制率EC50为21.10 mg/mL。所以鱿鱼抗氧化肽是一种具有抗疲劳和抗癌活性且性质相对稳定的活性肽。

鱿鱼,抗氧化肽,稳定性,抗疲劳,抗癌

抗氧化肽是最重要的生物活性肽之一,也是目前研究最为广泛的生物活性肽,尤其是利用海洋水产资源开发抗氧化肽[1-2]。目前国内外学者利用酶解技术和发酵技术从不同的蛋白质来源制备具有抗氧化活性的多肽,同时研究其工艺优化、分离纯化和活性功能[3-5],而对抗氧化肽的稳定性的研究相对较少。抗氧化肽在应用过程中因加工贮藏条件的影响,可能会发生水解、氧化、降解等反应,从而导致活性变化[6-8]。因此,研究其活性稳定性对于制定科学的生产工艺、应用和贮藏方法具有重要的指导意义。目前有关抗癌和抗疲劳的活性肽的开发也是热点,主要集中于大豆抗疲劳和抗癌活性肽[9-10],未见鱿鱼抗疲劳和抗癌活性肽的研究报道。本实验室前期通过可控酶解技术对鱿鱼肉进行酶解,通过响应面优化工艺得到了有较强抗氧化能力的多肽混合物[11],并对多肽进行抗氧化活性研究。本文进一步研究温度、pH、金属离子、防腐剂、食品配料对鱿鱼抗氧化肽清除DPPH·和OH·活性的影响,同时对鱿鱼抗氧化肽的抗疲劳和抗癌活性进行了初步研究,以期为鱿鱼抗氧化肽作为功能性食品配料的生产和应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

市售新鲜鱿鱼 洗净、去掉头和内脏后,用绞碎机绞成肉糜,置于-18 ℃冰箱中冷藏,备用;小鼠 体重18～20 g,雄性,广东省医学实验动物中心提供,实验动物许可证号:SCXK(粤)2008-0002;胃癌细胞系SGC-7901细胞 武汉博士得试剂公司;RPMI 1640培养液 上海索莱宝生物科技有限公司;木瓜蛋白酶 6000 U/mg,国药集团化学试剂有限公司;DPPH 购于Sigma公司;邻二氮菲、磷酸盐、EDTA、FeSO4、H2O2、无水乙醇 均为国产分析纯。

Cintra10紫外可见分光光度计 澳大利亚GBC公司;centrifuge5810R冷冻离心机 德国Eppendorf(艾本德)公司;MP1100B电子天平 上海济成分析仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司;Scientz-N真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;CO2培养箱 上海博迅实业有限公司;酶联免疫检测仪 美国BIO-RAD公司。

1.2实验方法

1.2.1 鱿鱼抗氧化肽制备工艺流程 鱿鱼肉→绞成肉糜→冷冻备用→解冻→加入木瓜蛋白酶→在蛋白酶的最适条件下进行酶解(pH5.8,加酶量为0.07 g/10 g鱿鱼,温度为55 ℃,酶解时间6 h)→将酶解液在沸水浴中灭酶15 min→冷却→离心(4800 r/min,20 min)→上清液→滤膜过滤(0.45 μm)→透析处理(3500 u)→透过液→浓缩→冷冻干燥→鱿鱼抗氧化肽[11]。

1.2.2 鱿鱼抗氧化肽清除DPPH·活性测定 采用Zhu等的方法[12],分别取2 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液置于6支试管中,分别加入0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL抗氧化肽溶液,使浓度分别达到5、10、15、20、25、30 mg/mL,同时补充蒸馏水至4 mL,室温放置30 min后,在517 nm处测定其吸光度值(Ai),以2 mL 95%乙醇加入2 mL蒸馏水调零,对照为2 mL DPPH·溶液加上2 mL 95%乙醇在517 nm测定吸光度值(Ac),不同浓度的抗氧化肽溶液和2 mL 95%乙醇混合后在517 nm测定吸光度值(Aj)。抗氧化肽对DPPH·的清除率用抑制率(R)计算公式为:

R(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式(1)

1.2.3 鱿鱼抗氧化肽清除OH·活性测定 采用邻二氮菲法测定抗氧化肽清除羟自由基活性[13]。测定方法如下:取6支试管,分别加入0.6 mL邻二氮菲溶液(5 mmol/L)加入0.4 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L,pH7.4)混匀后,分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL抗氧化肽溶液(浓度达到5、10、15、20、25、30 mg/mL)及0.6 mL EDTA(15 mmol/L),再次混匀后加入0.6 mL FeSO4溶液(5 mmol/L),以去离子水补至体积2.8 mL,充分混匀后加入0.8 mL H2O2(0.1%),摇匀后于37 ℃保温1 h,在536 nm处测吸光度值A样品。以去离子水代替样品,其余步骤同样品管,测得吸光度值为A损伤。以去离子水代替H2O2,其余步骤同损伤管,所测得吸光度值为A未损伤。按照下式计算OH·清除率:

清除率(%)=(A样品-A损伤)÷(A未损伤-A损伤)×100

式(2)

1.3各因素对鱿鱼抗氧化肽抗氧化活性的影响

1.3.1 温度对鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性的影响 将鱿鱼抗氧化肽(10 mg/mL)分别在20、40、60、80、100 ℃水浴中保温1 h后,快速冷却至室温,测其清除DPPH·和·OH的活性保持率。

1.3.2 pH对鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性的影响 将鱿鱼抗氧化肽(10 mg/mL)的pH分别调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,在室温下放置1 h,然后将各溶液的pH调至7.0,测其清除·OH与DPPH·的活性保持率。

1.3.3 金属离子对鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性的影响 分别在鱿鱼抗氧化肽(10 mg/mL)中添加1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+金属离子溶液,静置2 h后,测其清除·OH与DPPH·的活性保持率。

1.3.4 防腐剂苯甲酸钠对鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性的影响 在鱿鱼抗氧化肽(10 mg/mL)中分别添加质量分数为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.010%的苯甲酸钠溶液,测其清除·OH与DPPH·的活性保持率。

1.3.5 食品配料对鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性的影响 在鱿鱼抗氧化肽(10 mg/mL)中分别添加质量分数为1%、3%、5%、7%、9%的蔗糖、葡萄糖或质量分数为1%、2%、3%、4%、5%的氯化钠,在100 ℃的条件下放置20 mim后,测其清除·OH与DPPH·的活性保持率。

1.4鱿鱼抗氧化肽对小鼠抗疲劳的研究

采用小鼠力竭游泳时间来评价鱿鱼抗氧化肽对小鼠抗疲劳活性[14]。取60只体重在18～20 g雄性小鼠,采用国家标准饲养一周,随后将小鼠分为3组,空白组、鱿鱼抗氧化肽高剂量组(SAP-H)和鱿鱼抗氧化肽低剂量组(SAP-L),每组20只小鼠。在四周实验过程中,SAP-H组的小鼠灌胃10 mg/g·d的鱿鱼抗氧化肽,SAP-L组的小鼠灌胃2 mg/g·d的鱿鱼抗氧化肽,而空白组则灌胃蒸馏水。灌胃后小鼠休息30 min,然后进行游泳实验,第一周游泳时间为20 min,以后逐周增加5 min。在末次给药第一组空白、SAP-H和SAP-L之后,小鼠休息30 min,然后在小游泳池中进行力竭游泳时间的测定,泳池大小为50 cm×50 cm×40 cm,水深30 cm,水温25 ℃。不断搅动水池中的水,保证小鼠不停的游动。当小鼠头部沉入水中7 s仍不能正常地把头伸出水面,则认为小鼠进入力竭状态,记录从开始游泳到力竭状态的时间,该时间为力竭游泳时间。

1.5鱿鱼抗氧化肽的抗癌活性

采用体外对胃癌细胞SGC-7901抑制增殖作用来评价鱿鱼抗氧化肽的抗癌活性。参考葛锡娟等的方法[15-16],略加修改。SGC-7901胃癌细胞首先经过用RPMI 1640培养液培养细胞,待细胞成熟后,把细胞处理成单细胞悬液,以每孔1×105个/mL细胞浓度接种于96孔板上,每孔加0.1 mL,然后在37 ℃、体积分数5% CO2及饱和湿度条件下,培养24 h。然后加入浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40 mg/mL鱿鱼抗氧化肽,空白实验以溶解抗氧化肽的去离子水代替,同时设置5个平行孔。鱿鱼抗氧化肽添加完毕继续孵育48 h后,每孔加入5 mg/mL MTT(噻唑蓝)溶液20 μL,37 ℃继续孵育4 h,小心吸弃孔内培养上清液,控干后每孔加入150 μL DMSO(二甲基亚飒),轻轻振荡15 min,使蓝紫色甲瓉结晶物充分溶解。选择波长490 nm,在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度值(OD490),记录结果。计算抗氧化肽对癌细胞生长的增殖率和EC50值,同一实验重复三次,取平均值。增殖率计算公式如下:

增殖率(%)=(OD加样-OD空白)÷(OD对照-OD空白)×100

式(3)

1.6数据处理

所有实验重复3次以上,采用Excel和SPSS 19.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1温度对鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性的影响

由图1可见,鱿鱼抗氧化肽在20～100 ℃范围内,抗氧化活性变化不显著(p>0.05),即使在100 ℃处理0.5 h,其清除DPPH·和·OH的活性保持率仍在94%以上,说明鱿鱼抗氧化肽的热稳定性较强,在热加工过程中,活性保持较好。

图1 温度对鱿鱼抗氧化肽抗氧化活性的影响Fig.1 The influence of temperature on the antioxidant activity of squid antioxidant peptide

2.2 pH对鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性的影响

从图2可以看出,当pH<7时,鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性保持较好,其活性保持率都在90%以上;当pH>7时,随着pH升高,其清除·OH和DPPH·的活性保持率都显著下降(p<0.05)。鱿鱼抗氧化肽耐酸不耐碱,可能是因为在碱性条件下抗氧化肽提供的产生清除自由基效果的氢供体上的氢被消耗了,从而导致活性的降低[17]。

图2 pH对鱿鱼抗氧化肽抗氧化活性的影响Fig.2 The influence of pH values on the antioxidant activity of squid antioxidant peptide

2.3金属离子对鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性的影响

图3 不同金属离子对鱿鱼抗氧化肽抗氧化活性的影响 Fig.3 The influence of metal ions on the antioxidantactivity of squid antioxidant peptide注:A:清除·OH自由基活性稳定性;B:清除 DPPH·自由基活性稳定性。

不同金属离子对鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性的影响见图3所示,在一定的浓度范围内,随着离子浓度的升高,鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性均有不同程度的降低。随着Cu2+浓度的增加,鱿鱼多肽的抗氧化活性显著降低(p<0.05),当达到5.0 mmol/L时,其清除·OH和DPPH·的活性保持率只有39.25%和23.58%,Zn2+也与之类似。而Ca2+、Mg2+随着离子浓度的升高,其抗氧化活性虽然也有下降,但是下降并不显著(p>0.05)。Cu2+和Zn2+对抗氧化化活性影响较大,主要原因可能是Cu2+和Zn2+与抗氧化多肽通过共价键和离子键形成配合物的缘故[18]。所以鱿鱼抗氧化肽在加工和贮藏过程中应尽量避免与铜制或者锌制容器接触,尽量不要直接与富含Cu2+和Zn2+的原料混合加工。

2.4防腐剂苯甲酸钠对鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性的影响

由图4可以看出,在一定浓度范围内,随着苯甲酸钠浓度的升高,鱿鱼抗氧化肽的自由基清除活性保持率变化不显著(p>0.05),这表明苯甲酸钠对鱿鱼抗氧化肽的稳定性影响不大。与胡晓等[19]的研究结果一致。

图4 苯甲酸钠对鱿鱼抗氧化肽抗氧化活性的影晌Fig.4 The influence of sodium benzoate on the antioxidant activity of squid antioxidant peptide

2.5食品配料对鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性的影响

从图5可以看出,随着糖类浓度的增加,鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性均有所提高,且葡萄糖对鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性影响大于蔗糖,可能是因为抗氧化肽与糖类在加热条件下发生了美拉德反应,生成的醛、酮等还原性物质在一定程度上增加了鱿鱼多肽的抗氧化活性[20]。而美拉德反应中,糖类的反应速度大小为:还原糖>非还原糖,单糖>双糖,因此葡萄糖对鱿鱼多肽抗氧化活性的影响较大。从图6可以看出,NaCl对鱿鱼抗氧化肽的抗氧化活性影响不显著(p>0.05),当NaCl的添加量达到5.0%时,抗氧化肽清除DPPH·和·OH的活性损失率不到7%。说明NaCl对鱿鱼抗氧化肽稳定性的影响并不显著(p>0.05)。

图5 糖类对鱿鱼抗氧化肽抗氧化活性的影晌Fig.5 The influence of saccharide on the antioxidant activity of squid antioxidant peptide注:A:清除·OH自由基活性稳定性;B:清除DPPH·自由基活性稳定性。

图6 NaCl对鱿鱼抗氧化肽抗氧化活性的影晌Fig.6 The influence of NaCl on the antioxidant activity of squid antioxidant peptide

2.6鱿鱼抗氧化肽的抗疲劳活性

力竭游泳时间是评价抗运动疲劳的常用指标,从图7可见,鱿鱼抗氧化肽高剂量组的小鼠力竭游泳的平均时间为245.4 min,而低剂量组的小鼠力竭游泳的平均时间为221.6 min,两者并无显著差异(p>0.05)。但是比空白组的游泳时间延长了23%～36%,差异显著(p<0.01)。这说明了鱿鱼抗氧化肽具有延长小鼠力竭游泳时间的作用,具有一定的抗疲劳功效。

图7 鱿鱼抗氧化对小鼠力竭游泳时间的影晌Fig.7 Effect of squid antioxidant peptide on the swimming time in mice

2.7鱿鱼抗氧化肽的抗癌活性

从图8可以看出,鱿鱼抗氧化肽对胃癌细胞SGC-7901的增殖有明显的抑制作用。随着抗氧化肽浓度的增加,抑制癌细胞增殖的作用增强,当抗氧化肽浓度为40 mg/mL,细胞的增殖率仅为9.5%。通过拟合曲线计算得出,抗氧化肽抑制SGC-7901癌细胞增殖的EC50为21.10 mg/mL,与泥鳅多肽抑制HepG2 的EC5016.69 mg/mL比较接近[21]。所以鱿鱼抗氧化肽具有一定的抗癌活性。

图8 鱿鱼抗氧化肽对SGC-7901癌细胞抑制增殖作用Fig.8 The anti-proliferation effect of squid antioxidant peptide on SGC-7901 cancer cells

3 结论

本文以DPPH·和·OH清除率为指标,研究了鱿鱼抗氧化肽在不同条件下抗氧化的稳定性,结果表明:鱿鱼抗氧化肽热稳定性较好,100 ℃处理0.5 h抗氧化活性保持率在94%以上。鱿鱼抗氧化肽在酸性条件下活性保持率较好,在碱性条件下,抗氧化活性显著下降(p<0.05)。防腐剂苯甲酸钠对鱿鱼抗氧化肽活性影响不显著(p>0.05)。糖类对鱿鱼抗氧化肽活性有所增加,顺序为还原糖>非还原糖,单糖>双糖。NaCl对鱿鱼抗氧化肽稳定性的影响并不显著(p>0.05)。Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+金属离子对鱿鱼抗氧化肽稳定性均有不同程度的影响,影响顺序为Cu2+>Zn2+>Mg2+>Ca2+。通过抗疲劳和抗癌活性研究,鱿鱼抗氧化肽有较好的抗疲劳活性,与空白相比,抗氧化肽可以延长小鼠力竭游泳时间达到23%～36%,差异显著(p<0.05)。鱿鱼抗氧化肽对胃癌细胞SGC-7901的增殖有明显的抑制作用(p<0.05),半数抑制率EC50为21.10 mg/mL。鱿鱼抗氧化肽是一种具有抗疲劳和抗癌活性且性质相对稳定的活性肽,在实际应用过程注意避免影响其活性的因素。

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Thestabilityofantioxidantpeptidesfromsquidandtheiranti-fatigueandanti-canceractivities

HUXiao-jun,JIANGMin*,WANGBiao-shi,YUBing-sheng,MIAOWan-gen,FENGLing-ling

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Lingnan Normal University,Development Center for New Materials Engineering & Technology in Universities of Guangdong,Zhanjiang 524048,China)

The change of scavenging activity on DPPH and hydroxyl free radicals of antioxidant peptides from squid was used as the index to study the effect of temperature,pH,different metal ions,preservatives and food ingredients on antioxidation stability of the peptides. At the same time,the anti-fatigue and anti-cancer activities of antioxidant peptides from squid were preliminarily studied. The results showed that antioxidant peptides from squid had strong heat-resistance,still maintaining more than 94% of the activity when heated to 100 ℃. The peptides maintained high activity under acidic conditions,but losed their activity under alkaline conditions. Surcrose and NaCl had little effects on their antioxidation stability,but glucose and sodium benzoate lowered the oxidation stability of antioxidant peptides from squid(p<0.05). Metal ions such as Ca2+,Mg2+,Zn2+and Cu2+affected the stability and the order was Cu2+>Zn2+>Mg2+>Ca2+. Antioxidant peptides from squid had better anti-fatigue activity. Compared with the blank,antioxidant peptides could prolong the exhaustive swimming time of mice to 23%～36%. Antioxidant peptides from squid had significant inhibition on proliferation of gastric cancer cell SGC-7901. The inhibition rate of EC50was 21.10 mg/mL. Therefore,the antioxidant peptides from squid were a kind of active peptide with anti-fatigue,anti-cancer activity and stable property.

squid;antioxidant peptide;stability;anti-fatigue;anti-cancer

2017-02-07

胡小军(1977-),男,硕士,讲师,研究方向:食品的深加工与功能成分制备,E-mail:yan2001j@126.com。

*通讯作者:江敏(1977-),女,硕士,实验师,研究方向:食品加工技术与产品开发,E-mail:jiangmin9715@163.com。

国家级星火计划项目(2013GA780083);湛江市财政资金科技专项项目(2013C01029);2013年地方高校国家级大学生创新创业训练项目(2010404139);岭南师范学院热带与南海资源协同创新中心项目(CIL1503);岭南师范学院自然科学研究项目(YL1404)。

TS254.1

:A

:1002-0306(2017)16-0060-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.012