乙醇喷涂处理对年糕微生物及理化品质的影响

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(1.宁波大学海洋学院,浙江宁波 315211;2.宁波南衡进出口有限公司,浙江宁波 315000)

乙醇喷涂处理对年糕微生物及理化品质的影响

蔡怀依1,许翔1,袁爽1,雷丽萍1,娄永江1,*,邵君2

(1.宁波大学海洋学院,浙江宁波 315211;2.宁波南衡进出口有限公司,浙江宁波 315000)

为了探讨不同质量分数乙醇喷涂处理年糕对保鲜效果及腐败菌的影响,对经乙醇喷涂处理后的年糕定期测定水分含量、硬度、pH和色泽,以此评价品质变化,同时采用16S rDNA基因序列分析法鉴定年糕腐败菌。结果表明,与对照相比乙醇组处理均能显著(p<0.05)抑制年糕硬度的上升和色泽褐变、有效减少年糕水分的散失以及延缓pH的下降;乙醇组菌落总数和霉菌总数均显著低于对照组(p<0.01),且随着乙醇质量分数的增加,抑菌效果更好;年糕的优势腐败菌从初期的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)31.5%和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)32.3%,逐渐转变为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)63.2%。结果表明,乙醇喷涂处理在年糕保鲜中具有较好的抑菌作用,能延长年糕的货架期,在年糕保鲜中具有很好的应用前景。

乙醇,年糕,理化品质,优势腐败菌

年糕(rice pastry)是一种富含蛋白质、脂肪、碳水化合物以及多种矿质元素的传统米制品[1],但它的货架期较短,贮藏过程中容易发硬、色变、酸败、营养成分损失、微生物繁殖并导致腐败等[2-3],最终失去食用价值和商品价值。因此,年糕贮藏保鲜的研究具有重要的经济价值和实际生产意义。

目前年糕主要以散装年糕、热力灭菌年糕和保鲜年糕三种形式进行销售[4]。散装年糕品质优、口感爽滑、质地细腻、弹性好,更符合大众传统喜好,但在常温下仅能保存2～3 d。热力灭菌年糕虽然很好的解决了散装年糕保质期短的难题,可将年糕货架期延长到6个月以上,但在制备过程中需要进行高温杀菌，这样会使年糕发生褐变反应,造成品质下降,部分营养成分丧失,淀粉糊化变性,冷却过后会使年糕发硬[5-7],从而影响年糕这一传统食品的工业化持续发展。保鲜年糕是近年来针对散装年糕和热力灭菌年糕间的矛盾而生成的产物,主要通过使用保鲜防腐剂来有效延长年糕的保质期。但根据GB 2760-2014规定[8],年糕属于米制品不能添加任何防腐剂。而乙醇是一种已被美国食品和药物管理局(GRAS)公认的安全杀菌剂[9],且价廉易得,目前已在食品保鲜中得到应用。前人使用乙醇溶液浸泡的方法处理年糕,取得了不错的效果[10]。但是浸泡处理会消耗掉很多体积的乙醇溶液,在使用过程中溶液中的乙醇溶剂会吸附在年糕上而造成溶液质量分数下降,需要不断的添加乙醇来保证溶液中乙醇质量分数的稳定,过程繁琐,耗时耗力。因此找到一种更简单有效的抑制年糕腐败变质的方法迫在眉睫。本研究采用乙醇喷涂处理年糕,测定其在37 ℃下的保鲜效果,为延长年糕货架期提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

年糕 宁波江北五桥粮油食品有限责任公司;营养琼脂培养基(NA)、马铃薯大豆琼脂培养基(PDA)、胰酪胨大豆琼脂(TSA) 杭州微生物试剂有限公司;食用乙醇 郑州程达食品配料有限公司;PH0210细菌基因组DNA提取试剂盒 福州飞净生物科技有限公司;BufferBD、PW Solution、CE Buffer、Proteinase K、SYBR Green I核酸染料、TEA Tricine SDS Running Buffer、琼脂糖 奥格生物技术(上海)有限公司;实验用水 经Milli-Q Integral 5超纯水系统纯化。

YXQ-LS-100G立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅生物有限公司;SPX智能生化培养箱 宁波江南仪器厂;LX19-001型真空包装机 上海第二机电设备厂;NXL-500w质构仪 北京中慧天诚科技有限公司;SL320N电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司;TC-512 PCR仪 上海启步生物科技有限公司;FE28型pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;CM-700D色差仪 日本柯尼卡美能达控股株式会社;Eppendorf 5427R离心机 德国艾本德股份公司;IKA T25 degital均质机 德国IKA公司。

1.2实验方法

1.2.1 样品预处理 将刚生产出的年糕在无菌条件下切割成体积4 cm×4 cm×1 cm的若干块,随机分成6个组,每组90块。分别用无菌水配制不同质量分数35%(ET35%)、45%(ET45%)、55%(ET55%)、65%(ET65%)、75%(ET75%)的乙醇溶液,对照组(ET0%)用无菌水处理,将各组溶液分别置于手持喷雾器中,均匀喷涂于年糕表面,每片年糕约消耗0.3 mL乙醇溶液,进行真空包装,在温度为(37±0.5) ℃,相对湿度为95%的生化培养箱中贮藏,每隔5 d测定相关指标。

1.2.2 水分含量测定 按GB 5009.3-2010标准进行测定[11]。

1.2.3 硬度测定 用质构仪测定年糕的硬度。测定条件:P/5探头,测前速率3 mm/s;测试速率1 mm/s;测后速率1 mm/s;压缩程度为40%;时间间隔5 s,压缩次数2次;每组样品测试5次取平均值。质构曲线上第一次压缩时的最大峰值便为年糕的硬度值[12]。

1.2.4 pH测定 取年糕10 g,加入90 mL蒸馏水,均质6 s后8000 r/min离心5 min，取上清用pH计测定pH,每个样品测定3次取平均值。

1.2.5 色度测定 用色差计测定每组年糕。色度的变化由L*值的变化来表示,L*代表黑白偏差量,正数则表偏白,负数则表偏黑。每个处理组取10块进行测定,每块选取5个不同位置,测定L*值,测量结果取平均值。

1.2.6 菌落总数测定 按GB/T 4789.2-2010标准进行测定[13]。

1.2.7 霉菌总数测定 按GB/T 4789.15-2016标准进行测定[14]。

1.2.8 腐败菌株的鉴定

1.2.8.1 腐败菌株的分离纯化 取肉眼可见明显菌斑的对照组第4 d(CK4 d)、菌斑长满整个年糕表面对照组第15 d(CK15 d)和75%乙醇组第25 d(ET25 d)的年糕各25 g,加入225 mL生理盐水,剪碎后用均质机均质10 s。取不同稀释倍数的菌悬液,分别在TSA平板上进行稀释平板分离,并将平板置于37 ℃培养箱中培养48 h。选取菌数适合的计数平板,挑取不同菌落形态的菌体进行划线分离,并分别纯化3代。

1.2.8.2 细菌DNA提取 用无菌的接种环提取分离纯化后的菌体,接种到10 mL的TSB培养液中培养过夜(增菌)。取1 mL过夜培养的菌液,加入1.5 mL离心管中,室温8000 r/min离心1 min,弃上清,收集菌体。加入180 μL溶菌酶溶液,重悬菌液,37 ℃水浴30～60 min。再加入20 μL蛋白酶K溶液,振荡均匀。56 ℃水浴30 min至细菌完全裂解。依次加入200 μL BufferBD、200 μL无水乙醇充分颠倒混匀。将吸附柱放入收集管中,用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部吸入吸附柱中,静置2 min,再12000 r/min室温离心1 min,倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管,加入500 μL PW Solution,10000 r/min离心30 s倒掉滤液。将吸附柱放回收集管,加入500 μL Wash Solution,10000 r/min离心30 s倒掉滤液。将吸附柱重新放回收集管中,于12000 r/min室温离心2 min,离去残留的Wash Solution。取下吸附柱,放入一个新的1.5 mL的离心管中,加入50～100 μL CE Buffer静置3 min,12000 r/min室温离心2 min,收集DNA溶液。DNA产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,在凝胶成像系统中成像观察,并将提取后的DNA置于-20 ℃下保存备用。此DNA即PCR反应模板。

1.2.8.3 PCR扩增基因片段 采用通用引物PCR扩增16S rDNA 基因片段,建立25 μL PCR反应体系,包括:7.8 μL rTaq酶、1.0 μL DNA模板、上下游引物25 μmol/L各1 μL,用灭菌的去离子水(ddH2O)补至总体积25 μL。

扩增程序:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 min,53 ℃退火1 min,72 ℃延伸90 s;30个循环,最后72 ℃保持10 min。纯化的PCR产物于-20 ℃保存。16S rDNA扩增引物采用通用引物,正向引物有27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物为1492R:5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′,由上海捷瑞生物工程有限公司合成。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,然后在凝胶成像系统中成像观察。

1.2.8.4 16S rDNA序列测定及分析 将扩增成功的PCR产物送至上海生物工程有限公司进行测序,将测序结果导入NCBI的Blastn检索系统,在Nucleotide数据库中进行序列同源性比对。

1.3数据统计

采用Origin8.5和DPS7.05进行数据分析。

2 结果与分析

2.1乙醇喷涂对年糕水分含量的影响

米制品中水分含量下降越多,其食用品质和使用价值就越差[15]。因此,水分成为衡量年糕保鲜效果的重要指标。贮藏期间各组年糕水分含量的变化见图1。贮藏前5 d,对照组样品水分含量逐步降低,而乙醇组样品水分含量均有所升高,这是由于乙醇溶液处理样品后,增加了样品内的水分含量,从而使得曲线升高。而随着贮藏时间的延长,对照组年糕的水分损失更明显。从图1可知新鲜年糕的水分含量初始值MC0为44.8%,而对照组第20 d的水分含量MC20较MC0已下降了8.5%。相比之下,ET组的水分损失均小于对照组,ET35%和ET45%的MC20较MC0分别下降了0.3%和0.6%,而ET65%和ET75%的MC20较MC0分别下降了1.8%和2.6%。随着体系中乙醇质量分数的增加,乙醇分子间由于疏水水合作用逐渐聚集到了一起,造成年糕表面疏水基团与水分子总的作用面积减少,水分子氢键网状结构变得松散,最终一些水分子会脱离氢键网状结构并以大小不等的团簇存在于溶液中,而乙醇分子的亲水基团则与其周围的自由水分子通过氢键缔合在一起[16]。所以,乙醇处理年糕样品能在一定时间内减少年糕水分的散失,并且不同质量分数的乙醇处理年糕抑制水分散失的效果不同。其中,以35%乙醇溶液抑制年糕水分减少的效果最好,45%乙醇溶液处理组次之。

图1 年糕中水分含量变化趋势图Fig.1 Line charts of moisture content chang in rice pastry

2.2乙醇喷涂对年糕硬度的影响

硬度是年糕贮藏品质的一个重要指标。年糕中含有大量的直链淀粉,经加工煮熟后使得淀粉糊化,在糊化过程中,已经溶解膨胀的淀粉分子重新排列组合,在室温下形成一种类似天然淀粉结构的物质,这种现象称为淀粉的老化。淀粉老化致使食物发生变硬、变脆等不良现象,口感很快降低[17-18]。对照组和乙醇组样品硬度随时间的变化趋势见图2,贮藏前5 d,对照组曲线斜率最大,ET35%和ET45%次之,ET55%、ET65%和ET75%无明显变化趋势,曲线平缓。而随着贮藏时间的延长,各处理组的硬度均上升,其中对照组在整个贮藏期由初始硬度1398 g上升到2936 g,而效果较好的ET65%和ET75%硬度值分别上升了802、691 g。说明在整个贮藏期间,不同质量分数的乙醇溶液对抑制年糕硬度上升效果显著(p<0.05)。所以,乙醇能在一定程度上防止年糕老化变硬,其中,以75%乙醇处理组抑制年糕老化变硬的效果最好。

图2 年糕硬度变化趋势图Fig.2 Line charts of hardness chang in rice pastry

2.3乙醇喷涂对年糕pH的影响

pH也是判定年糕优劣的一个关键指标。通过不同质量分数乙醇喷涂处理年糕后,其pH均有不同程度的变化,变化趋势如图3所示。对照组和乙醇组pH均随储藏时间的延长呈下降趋势,相比之下,储藏5 d到20 d,pH下降较为缓慢。而储藏第20 d之后,pH下降趋势显著(p<0.05)。pH越小,表明样品的腐败程度相对越高。对照组初始pH0与第25 d pH25相差了1.9,下降幅度较乙醇组更为明显。乙醇各处理组pH下降速率减缓,这可能与乙醇的抑菌作用有关。pH下降最主要的原因在于滋生的微生物利用年糕中的营养物质而发酵产酸,而乙醇能在一定程度上抑制微生物的生长,使其发酵减少,产酸量下降,使得乙醇各处理组的pH均比对照组下降得缓慢,特别是年糕中的优势菌之一芽孢杆菌,能迅速消耗环境中的游离氧,造成环境低氧,并产生乳酸等有机酸类,进一步降低了pH,间接抑制其它腐败菌的生长[19-20]。对比pH和细菌总数、霉菌总数变化曲线也可以发现三者的变化趋势基本相同,说明年糕中微生物的生长繁殖直接影响到产品的pH,而乙醇的加入所起到的抑菌作用也进一步延缓了年糕pH的下降。并且,随着乙醇质量分数的增加,遏制pH下降的作用越显著,其中以ET75%处理的样品延缓年糕pH下降的效果最好。

图3 年糕pH变化趋势图Fig.3 Line charts of pH chang in rice pastry

2.4乙醇喷涂对年糕色度的影响

年糕在长时间贮藏会产生褐变现象,从而影响年糕外观和降低营养价值。各处理组的L*值虽在个别时间点上曲线有交叉现象,但总体上均呈前期逐渐降低,后期变化平稳的趋势(图4)。此外,由图4可知,在贮藏期第5 d对照组L*值极剧降低,初始L*值为78,第25 dL*值降为69,其L*值差均高于乙醇各处理组的年糕L*值差,表明年糕褐变明显。乙醇各处理组样品在整个贮藏期间,L*值曲线下滑趋势较小,且各处理组和对照组相比较,差异显著(p<0.05)。说明乙醇喷涂可明显延缓年糕色泽变化的效果,其中ET35%、ET45%、ET55%、ET65%组延缓年糕色泽变化的效果差别不大。在乙醇各处理组中以ET75%延缓色泽变化的效果最好。

图4 乙醇喷涂对年糕表层颜色(L*)的影响Fig.4 Effects of ethanol spraying on the surface color(L*)of rice pastry

2.5乙醇喷涂对年糕细菌和霉菌的影响

细菌总数和霉菌总数是年糕被微生物污染程度和卫生质量评价的两大重要指标。年糕表面与空气接触,使得空气里的微生物附着在其表面,一同进入真空包装袋中。整个贮藏期内,微生物数量呈现增长的趋势,如图5、图6的对照组所示,对照组样品在第5～10 d初始微生物数量就有了明显的增长(p<0.01)。在第5 d细菌总数和霉菌总数分别达到4.09、2.26 lgcfu/g,已经远超过了GB 4789.2-2010≤4.0 lgcfu/g和GB 4789.15-2010霉菌数≤2.19 lgcfu/g,失去了商品性。乙醇处理组样品在贮藏前5 d细菌总数和霉菌总数升高不明显,可能是由于乙醇能使菌体蛋白质凝固并脱水而发挥杀菌或抑菌作用。此外,在质量分数35%～75%的乙醇浓度范围内,乙醇浓度和细菌总数、霉菌总数呈现负相关,随着乙醇质量分数的增加,同一时间点细菌总数和霉菌总数逐渐减少,尤其是ET75%,在第25 d细菌总数和霉菌总数分别为1.97、0.32 lgcfu/g。由此可见,不同质量分数的乙醇均对年糕腐败菌有一定的抑制作用,而75%乙醇抑菌效果最好,这可能是由于75%乙醇与大部分微生物的渗透压相近,可以在菌体表面蛋白未变性前逐渐不断地向菌体内部渗入,使菌体所有蛋白脱水、变性凝固,最终杀死细菌,而当乙醇浓度低于75%时,由于渗透性降低,从而影响杀菌能力。

图5 年糕细菌总数的变化Fig.5 Changes of total bacteria count in rice pastry

图6 年糕霉菌总数的变化Fig.6 Changes of mold count in rice pastry

2.6优势腐败菌的鉴定

2.6.1 16S rDNA区域PCR扩增结果 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,然后在凝胶成像系统中成像观察。16S rDNA的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图见图7～图9。

图7 对照组腐败第4 d 16S rDNA PCR扩增的琼脂凝胶电泳图Fig.7 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplification of control group corroded on the 4th day

表1 16S rDNA序列比对分析Table 1 Sequence alignment analysis of 16S rDNA

图8 对照组腐败第15 d 16S rDNA PCR扩增的琼脂凝胶电泳图Fig.8 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplification of control group stained on the 15th day

图9 乙醇组腐败第25 d 16S rDNA PCR扩增的琼脂凝胶电泳图Fig.9 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplification of ethanol group tested on the 25th day

图7～图9均显示在400 bp附近出现明显的条带,表明扩增实验成功，能满足后续16S rDNA序列测定的需要。

2.6.2 测序及序列比对分析 通过分析对比琼脂凝胶电泳图,将各处理组PCR扩增产物送样测序,测序结果见表1。并将测序得到的16S rDNA序列用Blastn比对NCBI的核酸数据库,对比后的结果见表2。

由表1知,CK4 d种类较丰富,与Genbank数据库中最相似的序列的种属为:波茨坦短芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡状芽孢杆菌(Acilluscereus)、乙酰短杆菌(Exiguobacteriumacetylicum)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、希氏短杆菌(Brevibacillusbrevis)。乙醇处理组到达货架终点期时,由于喷涂液的杀菌抑菌作用,喷涂组比对照组菌相单一。腐败末期,对照组样品(CK15 d)的菌相有:波茨坦短芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡状芽孢杆菌(Acilluscereus)。可见,对照组优势菌株是巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis);乙醇喷涂样(ET25 d)菌相有:巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡状芽孢杆菌(Acilluscereus),其乙醇处理样的优势腐败菌是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

因此,年糕在37 ℃条件下贮藏,未处理的对照组优势菌株是巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),所占比例分别为31.5%、32.3%，这与胡庆松[21]等人的研究结果一致;而经乙醇喷雾处理样的优势菌株是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，所占比例为63.2%。

3 结论

乙醇能抑制年糕硬度的上升和年糕褐变、有效防止年糕水分的散失以及延缓pH的下降,使年糕在贮藏中保持优良的品质。此外,研究结果显示,造成年糕腐败变质的优势腐败菌是:巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌;通过乙醇喷涂处理后的样品,其优势腐败菌为枯草芽孢杆菌。

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Effectsofethanolsprayingonmicroorganismsandphysicochemicalqualityofricepastry

CAIHuai-yi1,XUXiang1,YUANShuang1,LEILi-ping1,LOUYong-jiang1,*,SHAOJun2

(1.School of Marine Science,Ningbo University,Ningbo 315211,China; 2.Ningbo Nanheng Import and Export Corporation Limited,Ningbo 315000,China)

In order to explore the effect of freshness preservation and spoilage bacteria by spraying ethanol with different mass fractions on rice pastry,this study evaluated quality changes of rice pastry sprayed on ethanol through regular tests of water content,hardness,pH and color. Meanwhile,the rice pastry sprouting bacteria were tested by adopting 16S rDNA gene sequence analysis. The results showed that compared with the control group,the ethanol treatment groups could significantly suppress the increase of hardness and the browning of rice pastry(p<0.05)and effectively reduce the water loss and delay the decrease of pH value. The total counts of bacteria and molds in the ethanol group were significantly lower than those in the control group(p<0.01).With the increase of ethanol content,the antibacterial effect was better. The dominant spoilage bacteria on rice pastry shifted from initiallyBacillusmegaterium31.5% andBacillussubtilis32.3% toBacillussubtilis63.2%. Conclusion:Ethanol spraying had a good antibacterial effect on rice pastry freshness preservation and could extend the shelf-life on rice pastry,which had a practical application on rice pastry freshness preservation.

ethanol;rice pastry;physicochemical properties;dominant spoilage bacteria

2017-03-16

蔡怀依(1992-)女，硕士研究生，主要从事食品加工与贮藏工程方面的研究，E-mail：750474737@qq.com。

*通讯作者:娄永江(1963-)男，硕士，教授，主要从事水产品加工与贮藏工程方面的研究,E-mail：louyongjiang@nbu.edu.cn。

TS202.3

:A

:1002-0306(2017)16-0291-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.055