高速动能破碎LC-MS/MS法检测动物性肉粉调味料中硝基呋喃代谢物残留

□ 王成梅 辛 堃 山东中质华检测试检验有限公司 曹文波 清华大学精仪系

高速动能破碎LC-MS/MS法检测动物性肉粉调味料中硝基呋喃代谢物残留

□ 王成梅 辛 堃 山东中质华检测试检验有限公司 曹文波 清华大学精仪系

本实验对比了超声快速衍生和传统振荡衍生的效果，优化了色谱质谱条件以及衍生条件。通过0．5、1．0、2．0三个浓度的加标回收，硝基

代谢物的回收率在90．7%～101．3%，相对标准偏差小于5%。在0．5～10 μg/kg时线性关系良好（r＞0．992），检出限为0．25 μg/kg。本方法快速、高效，而且可以大大节约时间和成本，提高了工作效率。

动物性肉粉；高速动能破碎；LC-MS/MS

目前，硝基呋喃类代谢物残留的检测最普遍的方法是采用液相色谱-串联质谱法[1]。在检测硝基呋喃代谢物残留的过程中需要经过酸水解，主要是因为在酸性条件下硝基呋喃代谢物可以和蛋白质分离[2]。本实验中首先通过高速动能破碎仪对样品进行60 s的高速均质破碎，使得样品破碎程度高，避免了提取过程中的乳化现象，同时采用避光水浴 40 ℃超声提取1 h。结果表明，采用该方法不仅能够大幅缩短反应时间，而且重现性好精密度高，实现了快速检测硝基呋喃代谢物的要求。在实验过程中采用同位素内标法，提高定量的准确性。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

仪器：Agilent液相色谱-质谱联用仪（1260-6460）；高速动能均质仪；离心机；旋转蒸发仪；恒温水浴摇床；涡旋混合器；电子天平；pH计。

硝基呋喃代谢物的标准品：3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）；5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）；1-氨基-2-内酰脲（AHD）；氨基脲（SEM）以及同位素内标AOZD4和AMOZ-D5购于德国Dr.E公司；AHD-13C 和SEM. HCl-13C-15N2，购于德国Witega公司。

试剂：2-硝基苯甲醛；甲醇、乙腈、乙酸铵、甲酸（HPLC级）；乙酸乙酯、正己烷、1 mol/L氢氧化钠、0.2 mol/L盐酸和2 mol/L磷酸氢二钾（分析纯）。

1.2 标准溶液的配制

四种硝基呋喃代谢物标准贮备液：准确称取硝基呋喃代谢物标准物质，用甲醇配成1 mg/mL的标准储配液，-18 ℃冷冻避光保存。

四种硝基呋喃代谢物混合标准工作液（10 μg/mL）：取适量的硝基呋喃代谢物的标准贮备液，用甲醇稀释成10 μg/mL的混合工作使用液，-18 ℃冷藏避光保存，使用前回到室温左右。

氘代内标混合液储备液（1 mg/ mL）：分别准确氘代内标物用甲醇溶解，配制成0.1 mg/mL的标准储备液，-18℃冷冻避光保存，有效期为6个月。

氘代内标混合工作使用液（0.1 mg/L）：准确吸取一定量的氘代内标混合工作储备液，用甲醇稀释成浓度为0.1 mg/L的混合工作使用液，冷藏避光保存，有效期为1个月。

2-硝基苯甲醛衍生溶液：准确称取0.15 g 2-硝基苯甲醛，用甲醇定容至10 mL，现用现配。

1.3 样品前处理

水解和衍生：称取2 g经过高速动能破碎仪高速均质的样品于50 mL的离心管中，加入10 mL 0.2 mol/L的盐酸高速均质进行酸解。加入1 mg/L混合内标工作液100 μL和100 μL 2-硝基苯甲醛衍生试剂，涡旋混匀30 s，避光水浴40 ℃超声震荡1 h。

提取：取出样品，冷却至室温。用1 mol/L的磷酸氢二钾和2 mol/L的氢氧化钠调节pH值至7.0～7.2。加入5 mL乙酸乙酯， 涡混匀，9 000 r/ min离心5 min，重复提取1次合并上层清液至10 mL离心管中，于40 ℃下旋转蒸发至干，残留物用1 mL甲酸（0.1%）水溶液溶解。再加入3 mL 正己烷去脂 涡混匀1 min后，以9 000 r/min离心5 min，取下层过0.22 μm滤膜上机分析。

1.4 色谱条件

Agilent高效液相色谱柱为 Eclipse Plus C18（2.7 μm，2.1 mm×50 mm）；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；流速：0.4 mL/min；梯度洗脱条件见表1。

1.5 质谱条件

离子源为电喷雾离子源；正离子模式下多重反应检测；毛细管电压：4 000 V；离子源温度：350 ℃；脱溶剂气压力：40 psi；脱溶剂气流量：11 L/min。MRM 分析参数见表2。

2 结果与分析

研究发现40 ℃超声避光振荡1 h以上，实验结果趋于稳定，重现性好。使用磷酸氢二钾和氢氧化钠调节pH值，不同样品加入量有区别，每个样品都要仔细加入不同的量，来回调整耗时长。实验发现pH值在7.0～7.5时，效果好且没有显著区别。利用前几个样品摸索好加入缓冲液的量，可以进一步缩短实验时间。

流动相初始溶液溶解样品后，对于脂肪含量较高的样品，由于基质干扰严重，直接过膜上机其液体非常浑浊，采用3 mL正己烷去脂，过膜，上机液清澈，基质干扰小。研究发现，加入正己烷结合高速离心，除杂质效果更好。

笔者选用了鸡肉、鱼肉粉等作为实验样品。实验通过一种高速动能破碎仪，使样品在极短的时间可进行高速地均质，造成组织和细胞破碎、代谢物流出，避免在提取过程中由于基质复杂且含油量大而造成的乳化现象，有利于提高提取率，缩短提取时间。四种硝基呋喃代谢物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限，见表3。

本实验采用高速动能破碎仪，不仅可以使样品分散均匀，避免在提取过程中造成油脂过高的乳化现象，同时实验过程中采用高速冷冻离心进一步净化样品。前处理时间短、提取率高，在很大程度避免了基质复杂提取过程中造成的乳化现象，非常适合调味料粉中硝基呋喃代谢物类的检测。

3 结语

呋喃代谢物在酸性条件下可以和蛋白质分离，加入衍生试剂后可以形成比较大的分子避开小分子离子的干扰，获得较高的灵敏度和特异性。而衍生在本实验中通过改进具有以下优点：①本实验建立了一种高速动能提取动物性肉粉调味料中硝基呋喃类代谢物的检测方法，提高了工作效率，缩短了时间；②采用高速动能破碎仪对样品进行高速均质，使样品最大程度地分散，不仅可以有效降低乳化现象，并有助于分层提取，提高回收率。而且样品处理过程时间短，大大提高了工作效率；③改进前处理过程，采用了水浴超声快速衍生的方法，通过40 ℃超声避光提取1 h，比传统的16 h衍生水解缩短了提取时间，提高了工作效率，而且重现性好精密度高；④对于脂肪含量较高的样品，加入正己烷结合高速离心，可以提高除杂质效果；⑤在分析复杂基质LC-MS/MS时，常会出现基质效应，影响定量分析的准确性和精明度。本实验采用同位素内标法，减少了外标法过程中存在的干扰，使定量变得更准确。

表1 四种硝基呋喃类代谢物的液相色谱条件表

表2 硝基呋喃代谢物及其内标物的质谱条件

表3 硝基呋喃类代谢物的线性、相关系数、检出限和定量限表

[1]贾涛．饲料中硝基 类药物的检测研究进展[J]．饲料与畜牧，2011(7)：37-40．

[2]蒋原，丁涛，沈崇 ，等．液相色谱-电喷雾质谱联用仪检测蜂蜜中四种硝基 类代谢物[J]．畜牧与兽医，2005(3)：12-15．