香菇多糖的抑菌效果试验

路志芳 蒋鹏飞

（安阳工学院生物与食品工程学院，河南安阳 455000）

香菇多糖的抑菌效果试验

路志芳 蒋鹏飞

（安阳工学院生物与食品工程学院，河南安阳 455000）

香菇中的多糖成分具有多种生物活性，广泛应用于各个行业，在食品行业中可做为天然防腐剂。本试验以干香菇为主要原料，利用热水浸提法充分提取香菇中的活性多糖，用葡萄糖标准曲线计算出香菇多糖纯度。为探究香菇多糖对细菌的抑制作用，我们采用紫外分光光度法研究香菇多糖对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑制性能，并探讨在不同时间、pH值和多糖浓度与其抗菌活性之间的关系。试验结果表明，香菇多糖对大肠杆菌抑制作用在24h时达到最大，对枯草芽孢杆菌在12h时达到最大；pH值为5时对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑制作用最大。

香菇多糖；抑菌活性；分光光度法；热水浸提法

香菇多糖广泛应用于医疗行业，目前已利用香菇多糖开发出一系列抗病毒、抗肿瘤药物。香菇多糖不仅可制成针剂，用来作为抑制肝炎和癌症扩散的辅助药物，而且香菇多糖硫酸酯化产品还可用来制备抑制艾滋病的辅助药物。香菇多糖也广泛应用于保健食品领域，其中活性多糖作为功能性因子，具有提高或调整人体免疫机能、降低胆固醇、预防冠心病和心脑血管疾病等作用。本试验以干香菇为原材料，利用热水浸提法来提取香菇多糖，研究香菇多糖在不同时间、pH值、浓度等条件下对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌性能，为香菇多糖作为抑菌剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为干香菇，食品级，安阳市丹尼斯责任有限公司提供；氯仿、正丁醇、浓硫酸、苯酚、无水乙醇、医用纱布、蛋白胨、牛肉膏、柠檬酸、氯化钠、葡萄糖、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，安阳工学院生物与食品工程学院试验室提供。试验设备为电热恒温水浴锅，型号HH-6，国华电器有限公司生产；紫外可见分光光度计，型号TU-1810DASPC，北京普析通用有限责任公司生产；立式压力蒸汽灭菌器，型号LDZH-100KBS，上海申安医疗器械厂；涡旋振荡器，型号Vortex 4 basic，德国IKA公司生产；电热恒温鼓风干燥箱，型号DGG-970B，上海森信试验仪器有限公司生产；双人单面净化工作台，型号SW-CJ-2D，苏州净化设备有限公司生产；全温震荡培养箱，型号MX-QUAN，常州梅香仪器有限公司生产；离心机，型号TGL-19，四川蜀科仪器有限公司生产；粉碎机，型号FW-400A，北京中兴伟业仪器有限公司生产；旋转蒸发器，型号41K30RA-C，巩义市予华仪器有限责任公司生产。

1.2 热水浸提法提取香菇多糖的工艺流程

先剔除干香菇中的杂质，然后将香菇用刀切块，用粉碎机打成粉，置于阴凉处备用。取10g香菇粉置于500mL烧杯中，按1∶40比例加入400mL蒸馏水，经过90℃水浴加热3h。水浴过程中用玻璃棒不断搅拌，使其充分加热。水浴后，用8层纱布将烧杯内液体过滤，去除残渣，滤液转入另一烧杯中待用。将烧杯中滤液倒入旋转浓缩仪上的圆底烧瓶中，用旋转浓缩仪进行浓缩，浓缩条件为-0.1MPa、70℃，浓缩后的溶液体积为原体积的1/4左右。用10000r/min离心机将浓缩液离心10min，将浓缩液转移至烧杯中，除去残留的杂物。在浓缩液中加入等体积的氯仿正丁醇溶液（体积比为4∶1），用玻璃棒充分搅拌5min，静置30min。将混合液体在5000r/min离心机下离心20min，分离水相。加入浓度为80%的酒精，用玻璃棒搅拌均匀后，静置20min，在5000r/min离心机下离心20min。取出粗多糖，放入已称重的干燥的表面皿中，在真空干燥箱中干燥（80℃，6h）。称重，计算粗多糖的产率。称取干燥后粗多糖10mg置于烧杯中加蒸馏水溶解，于250mL容量瓶中定容。取定容后的溶液2mL加入6%苯酚1mL，混合均匀，再慢慢加入浓硫酸5mL，充分混匀，放置20min后，用分光光度计于波长490nm测吸光度。称取葡萄糖10mg加蒸馏水溶解于烧杯，于250mL容量瓶中定容，分别取0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL及1.8mL，补水至2mL，加入6%苯酚1mL，混合均匀，再慢慢加入浓硫酸5mL，充分混匀，放置20min后，用分光光度计于波长490nm测吸光度A，根据葡萄糖浓度和吸光度绘制标准曲线。根据香菇多糖吸光度和葡萄糖标准曲线，计算粗多糖纯度。

1.3 香菇多糖抑菌试验流程

（1）制备牛肉膏蛋白胨液体培养基：准确称取蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g，倒入1000mL蒸馏水中水浴加热，用玻璃棒搅拌溶解，充分溶解。用酸度计检测，用2%NaOH溶液或0.1moL/L柠檬酸溶液调节pH值至7.2，分装在三角瓶中，包扎，高压灭菌锅灭菌（121℃湿热灭菌15min），待用。（2）配制无菌生理盐水：称取9g NaCL溶于1000mL蒸馏水中，分装在三角瓶中，加塞，包扎，高压灭菌（121℃，15min），备用。（3）菌悬液制备：在无菌操作台，用接种环挑取斜面培养基上1～2个大小适宜的菌落接种在液体培养基中，摇床培养（37℃培养24h）即可得到一定浓度的菌悬液。在无菌环境中用无菌生理盐水稀释菌悬液，使菌悬液的吸光值分布在0.6～0.8之间，封口放置在4℃冰箱中保存备用。（4）不同时间香菇多糖对两种菌的抑制作用：在无菌条件下，分别取稀释过的菌悬液18mL置于试管中，用移液枪吸取400μL浓度为1g/L香菇多糖溶液，并用旋涡混匀器混匀后，在37℃摇床中培养，以不加香菇多糖溶液的菌悬液作对照，以蒸馏水作为空白对照。每隔12h测定1次菌悬液的吸光度值A，共测定4次，重复3次，取平均值，计算其抑菌率，确定最适作用时间。（5）不同pH值香菇多糖对两种菌的抑制作用：在无菌条件下，分别取上述菌悬液18mL，用移液枪吸取400μL浓度为1g/L香菇多糖溶液，用酸度计检测，用0.2moL/L柠檬酸或1.0%NaOH溶液调解菌悬液pH值为5、6、7、8、9，用旋涡混合器混匀后，在37℃摇床培养24h，以不加香菇多糖液的菌悬液作对照，以蒸馏水作空白对照，测其吸光度值A，重复3次，取平均值，计算出抑菌率，确定最适作用的pH值。（6）不同浓度香菇多糖对两种菌的抑制作用：在上述最适条件下，用蒸馏水将香菇多糖溶液的浓度稀释成1g/L、0.5g/L、0.25g/L、0.125g/L、0.0625g/L。在超净工作台中，分别取上述菌悬液18mL，用移液枪吸取不同浓度的香菇多糖液400μL，用旋涡混合器混匀，在37℃摇床培养24h，以不加香菇多糖液的菌悬液作对照，以蒸馏水作空白对照，测其吸光度值A，重复3次，取平均值，并计算出抑菌率。

抑菌率（%）=｛［菌悬液吸光度值-（菌悬液加多糖吸光度值-多糖的吸光度值）］/菌悬液吸光度值］｝×100。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

图1为葡萄糖标准曲线，根据香菇多糖吸光度和葡萄糖标准曲线，计算出粗多糖纯度为42.15%。

2.2 不同时间对香菇多糖抑菌性能的影响

由图2可知，香菇多糖对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌都有明显的抑制作用，但抑菌效果达到峰值的时间有所差异。对枯草芽孢杆菌的抑制作用在12h时达到最大，对大肠杆菌的抑菌效果在24h时达到最大，并且对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌率均达到90%以上，但随着时间的推移，香菇多糖的抑菌性能不断减弱。

图1 葡萄糖标准曲线

图2 不同时间对香菇多糖抑菌性能的影响

2.3 不同pH值对香菇多糖抑菌性能的影响

由图3可知，不同pH值条件下，香菇多糖对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌性能有少许不同。pH值为5时，香菇多糖对两种菌的抑菌效果均为峰值，达到了100%，随着pH值增大，香菇多糖对大肠杆菌的抑菌效果明显降低，而对枯草芽孢杆菌的抑菌效果没有显著变化。

2.4 不同浓度对香菇多糖抑菌性能的影响

根据图2和图3确定了香菇多糖的最佳抑菌条件，由图4可知，随着香菇多糖溶液浓度的升高，其对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌性能均逐渐增大，当香菇多糖溶液的浓度达1g/L时，抑菌率分别达100%和95%左右。

图3 不同pH值对香菇多糖抑菌性能的影响

图4 不同浓度对香菇多糖抑菌性能的影响

3 小结

本试验采用热水浸提法从干香菇中提取活性多糖，通过苯酚硫酸法绘制葡萄糖的浓度与吸光度的标准曲线，计算出粗多糖的纯度，采用分光光度法测定了香菇多糖在不同条件下的抑菌活性。用热水浸提法提取香菇多糖提取率为3.2%，纯度为42.15%。香菇多糖对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均有一定的抑制作用，对大肠杆菌抑制效果在24h时达到最大，对枯草芽孢杆菌抑菌效果在12h时达到最大。对两种菌的抑菌效果，酸性条件下好于碱性条件下。不同浓度的香菇多糖对两种菌的抑制效果有所不同，但都随着香菇多糖溶液浓度的升高而升高。