在廉价高分子材料表面采用化学镀金法制备接触式电导检测器及其在PCR产物分析中的初步应用*

吴 剑，张 叶

（安徽中医药高等专科学校，安徽芜湖 241000）

在廉价高分子材料表面采用化学镀金法制备接触式电导检测器及其在PCR产物分析中的初步应用*

吴 剑，张 叶

（安徽中医药高等专科学校，安徽芜湖 241000）

化学镀金；接触式电导检测器；PCR产物分析

PCR（聚合酶链式反应）微芯片是运用多种方法在硅片、硅橡胶等材料上加工微管道、微反应室等，实现芯片上的快速PCR扩增，具有快速、高效、试剂消耗少等优点，是近年生命科学领域的研究热点之一[1-2]。PCR扩增产物为核酸，其检测方法有荧光分光光度法、定量PCR法和数字PCR拷贝数计数法等[3-6]，但均需用到较为庞大的检测仪器，因此便携性差。电化学方法仪器便携性好，如果能直接作为PCR微芯片的检测元件能明显提高微芯片的便携性，可为在一些特殊场所，如中药的野外检测等方面提供技术支持。为此，本研究采用化学镀金-转移法制作了接触式电导检测器，并将其应用于凤丹皮PCR扩增产物的检测中，效果较好。该检测器虽然检测灵敏度不高，但是制作成本低廉、仪器的便携性好，可应用于上述特殊场所进行药材的初步筛查，因此具有一定的应用价值。现报告如下：

1 实验部分

1.1 试剂、用品和仪器 聚二甲基硅氧烷(PDMS)Sylgard 184，Dow Corning(Midland, MI,美国)公司；HAuCl4，上海化学试剂有限公司；甲醛，上海凌峰化学试剂有限公司；抗坏血酸，国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖，上海生物科学与技术有限公司；KHCO3，温州化学试剂厂；透明环氧树脂水晶胶（绿循化工商行，江苏，昆山）；E625型硅橡胶，深圳红叶杰公司（深圳，中国）。1×TBE缓冲溶液：分别称取Tris 10.8g、Na2B4O7・2H2O 0.744g、 硼酸5.5g置于烧杯中，加50ml水搅拌溶解，转移到100ml容量瓶中摇匀、定容，0.45μm滤膜过滤，超声去气备用，溶液pH=8.7。维修佬焊锡丝0.2mm，淘宝网。所用试剂除特别标明外，均为分析纯；所有试剂均用18Mcm的Millipore水配制。

1.2 硅橡胶表面化学镀金条件研究 虽有研究者[7]在PDMS表面进行了化学镀金研究，且该方法环保性好，但PDMS较为昂贵。本研究使用廉价的E625型硅橡胶，在其表面进行了化学镀金的配方研究。

在一块固化后的E625型硅胶上打孔、清洗干净、烘干，紧密贴合在另外一片固化后的E625型硅胶表面，所打小孔作为化学镀金槽（见图1a）。镀液所用试剂包括：主盐，1%氯金酸；还原剂，2%葡萄糖或0.3%甲醛水溶液或1%抗坏血酸；缓冲溶液，20%碳酸氢钾。将主盐、一种还原剂、缓冲溶液和水按照正交实验设计软件设计出的不同镀液配方进行调配、混匀，注射到上述镀金槽内，同一配方的镀液重复注射到5个不同的槽内，视频监控镀金过程，完成后用目测法观察镀层情况（见图1b），用万用表考察镀层的导电性能并作出评价。

图1 化学镀金工艺研究槽化学镀金及结果

1.3 集成电导电极微芯片的制作 将少量硅橡胶按照最佳单体比例，混合倾注到培养皿的底部，并覆盖培养皿的整个底部，硅橡胶厚度约为0.1mm，保持底部水平静置1小时，待基本固化；将用焊锡丝、面粉制备的微管道模板放置到上述硅橡胶的表面，继续静置约1小时待硅橡胶完全固化。此时，部分焊锡丝模板嵌入固化后的硅橡胶内。

将热熔胶用热熔胶枪加热浇筑在在上述模板表面，待其固化后剥离获得带管道的热熔胶模板，并且该模板可重复使用。

硅橡胶按照最佳单体比例倾倒在上述热熔胶模板内，待硅橡胶固化制备硅橡胶阳模。在硅橡胶阳模下端凸起的阳模适当位置的两边，用固化后的PDMS块围成电导电极的形状，在PDMS块和管道凸起部分组成的两个围堰内，分别注入最佳比例的化学镀金液，静置待形成镀金层。

将水晶胶（由A、B两组分组成）按A：B=3:1的比例混合均匀，倾倒在镀金后的硅橡胶模板表面，待固化后剥离获得带管道和电导电极的水晶胶基电泳芯片下片。将PDMS按照单体：固化剂=10：1的比例配置混合均匀倾倒在另一培养皿中，静置，气泡脱净后60℃加热1小时，待固化后切割成所需要的形状作为上片，在PDMS上片的适合位置打孔，形成进样口、废液口等。将上下片贴合在一起，制成集成电导电极的复合电泳芯片（整个制备过程见图2）。在两个电导电极后端引出引线，连接在EZ-1电导率测试笔的两个电极上。

图2 集成电导电极微芯片制作过程示意图

1.4 使用电泳芯片检测凤丹皮PCR扩增产物 凤丹皮DNA提取物进行PCR扩增，将扩增产物引入上述自制集成电导电极微芯片的进样口，在1×TBE缓冲溶液下电泳分离，用电导率仪进行检测，用监控摄像头监控、记录数据的变化，所得结果整理后获得电泳曲线。

2 讨论

2.1 化学镀金条件的研究 研究发现，配方甲醛、碳酸氢钾、氯金酸、水比例为1:0.5:1.5:1，硅橡胶单体A:B=1:0.8时化学镀成功率高，可出现光亮的化学镀层，且导电性能良好。另研究发现，化学镀金时温度升高化学镀所需时间减少，但当温度超过35℃时难以生成化学镀层，原因可能是在该温度下镀液中水分蒸发严重导致镀液不稳定。因此，在施镀时应控制反应温度在25℃左右。

2.2 检测凤丹皮PCR扩增产物 凤丹皮PCR扩增产物电泳曲线见图3，可见电泳芯片的响应数据（图3）出现了一些较为明显的响应，可确定是扩增产物的响应（与常规的扩增产物电泳法获得的响应对比，图3）。

图3 凤丹皮PCR扩增产物的电泳曲线

3 小结

本研究利用硅橡胶表面化学镀金法制备了接触式电导检测器，并用于检测了凤丹皮的PCR扩增产物。该芯片制备过程简单、成本低廉，制备的芯片可应用在PCR产物的检测中，对中药材的初步筛查等有一定的应用价值。

[1]陈文元,张卫平.集成微流控聚合物PCR芯片[M].上海:上海交通大学出版社,2009.35.

[2]赵树弥,朱灵,朱灿灿,等.集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统[J].分析化学,2014,42(10):1393-1399.

[3]张璐.微量DNA检验技术及应用—微量DNA检验技术及展望[J].警察技术,2012（,2）:3-6.

[4]李亮,张秀杰,宛煜嵩,等.脱氧核糖核酸定量的潜在基准方法研究进展[J].中国农业科技导报,2013,15（1）:158-163

[5]任广睦,刘季,王英元.实时荧光定量PCR技术应用于核酸定量检测的研究进展及展望[J].山西医科大学学报,2007, 37（9）:973-976.

[6]朱强远,杨文秀,高一博,等.一种可绝对定量核酸的数字PCR微流控芯片[J].高等学校化学学报,2013,34（3）:545-550.

[7]Wu J,Bai H,Zhang X,et al.Thermal/Plasma-Driven reversible wettability switching of a bare gold film on a poly(dimethylsiloxane) surface by electroless plating[J].Langmuir,2010,26(2): 1191-1198.

(技术方法栏目编辑：张 健)

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1004-6879（2017）05-0417-02

2016-12-21）

* 安徽省教育厅自然科学基金项目（KJ2012B081），2014年高校优秀青年人才支持计划（皖教秘人[2014]181号）