不同固定时间和烤片时间对乳腺浸润性导管癌HER-2、p16免疫组化染色的影响

陈志强，王 莹，米贤军，钟守军，陈 昂，邓文同

不同固定时间和烤片时间对乳腺浸润性导管癌HER-2、p16免疫组化染色的影响

陈志强，王 莹，米贤军，钟守军，陈 昂，邓文同

乳腺肿瘤；免疫组织化学；HER-2蛋白；p16蛋白

免疫组化是应用抗原与抗体特异性结合的原理，为肿瘤的鉴定、来源、分型及发现微小转移灶的研究提供重要的分析诊断方法[1]。免疫组化操作步骤繁琐、操作过程影响因素较易误诊。一方面，由于组织固定不当引起的。固定不当可引起组织结构发生自溶和定位不确[2]。另一方面，烤片时间也常常影响免疫组化染色效果[3]。本实验拟通过比较86例乳腺浸润性导管癌组织在不同固定及烤片时间下进行HER-2、p16蛋白免疫组化染色的差异，为乳腺浸润性导管癌组织HER-2、p16蛋白免疫组化染色标准化提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及仪器 SAKURA Tissue Tek Vip-5全自动密闭式组织脱水机为日本樱花检验仪器株式会社生产，Thermo HM325轮转石蜡切片机为德国Thermo生产，DHG-9140A电热恒温干燥箱由上海精宏公司生产，BenchMark XT自动免疫组化染色机由美国Ventana公司生产。HER-2抗体、p16抗体及免疫组化检测试剂盒均购自美国Ventana MedicalSystems公司。

1.1.2 研究对象 收集中山市博爱医院2015年8月～2016年10月存档的临床病理资料完整的原发性乳腺癌86例。患者均为女性，年龄27～78岁，平均53.8岁。术前均未行任何辅助治疗(内分泌治疗、放疗、化疗)，病理诊断均为乳腺浸润性导管癌。各标本均见明显的肿瘤，组织按照标准取材大小(0.5 cm×0.3 cm×0.2 cm)切取。

1.2 方法

1.2.1 标本制备 标本经10%中性缓冲福尔马林中分别固定2、5、10、15、24 h后进入常规石蜡切片程序，裱片于防脱载玻片上，放置于75 ℃温箱烤片，分别烤10、15、30、60、120 min。

1.2.2 免疫组化 烘干的切片在Bench Mark XT自动免疫组化染色机进行染色，中性树胶封固。每次染色均以PBS代替一抗作阴性对照，用已知乳腺浸润性导管癌HER-2、p16蛋白阳性标本作阳性对照。

1.2.3 结果判断与评分 HER-2蛋白染色结果的评定参考《乳腺癌HER-2检测指南(2014版)》标准[4]：0和1+为阴性，2+为不确定，3+为阳性。p16蛋白依据阳性细胞率计算：阳性细胞数<1%为(-)，1%～10%为(1+)，11%～50%为(2+)，>50%为(3+)。每张组织切片的免疫组化染色均在相同的实验条件下进行，以保证结果的客观性和可靠性。

2 结果

2.1 不同固定时间的HER-2、p16蛋白染色结果 75 ℃烤箱中烤片30 min，HER-2蛋白固定时间为15 h，样品的阳性率为24.42%，显著高于固定时间为2、5、10、24 h的各处理组(P<0.05)；p16蛋白固定时间为15 h，样品的阳性率为48.84%，显著高于固定时间为2、5、10、24 h的各处理组(P<0.05，表1)。

表1 不同固定时间标本HER-2、p16蛋白免疫组化染色结果

与固定时间15 h组相比，aP<0.05

2.2 不同烤片时间处理标本的HER-2、p16蛋白染色结果 组织固定时间为15 h，在75 ℃烤箱中烤片30 min，HER-2蛋白阳性率为25.58%，显著高于10、15、60、120 min的各处理组(P<0.05)；p16蛋白的阳性率为46.51%，显著高于10、15、60、120 min的各处理组(P<0.05，表2)。

表2 不同烤片时间处理标本HER-2、p16蛋白染色结果

与烤片时间30 min组相比，aP<0.05

3 讨论

HER-2蛋白是相对分子质量为18.5×104的跨膜蛋白，是乳腺癌患者重要的治疗及预后指标，可指导靶向药物的选择、判断预后[5]。p16蛋白是相对分子质量为1.6×104的蛋白，细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)抑制因子，该基因结构或功能上的缺失导致细胞异常生长，导致人类恶性肿瘤的发生[6]。免疫组化是检测HER-2、p16蛋白最常用的方法，组织固定、烤片是免疫组化检测过程中的重要环节。免疫组化操作过程步骤较多、不稳定性因素增加、检测结果易受诸多因素的影响，但最主要的影响因素是组织前期处理中的固定、烤片环节，它们也是影响实验室间检测结果准确性和可重复性的主要因素[7]。

本实验对HER-2、p16蛋白的固定时间进行了实验探索。结果表明，用10%中性缓冲福尔马林固定乳腺癌浸润性导管癌标本15 h，75 ℃烤箱中烤片30 min，HER-2蛋白阳性率为24.42%，与Rakha等[8]研究证实在20%～30%的原发性浸润性乳腺癌中有HER-2蛋白的过表达相符。用10%中性福尔马林固定乳腺癌浸润性导管癌标本15 h，75 ℃烤箱中烤片30 min，p16蛋白得到了最佳免疫染色效果，与聂艳红等[6]报道结果基本相符。

综上所述，以HER-2、p16蛋白为目标抗原研究乳腺浸润性导管癌免疫组化染色效果，如何选择固定与烤片时间，归根到底是选择使组织内抗原的保存及暴露恰到好处、获得最佳染色效果的时间。

[1] 陈 艳, 潘美华. 全自动免疫组化仪与手工操作应用体会[J]. 临床与实验病理学杂志, 2015,31(6):708.

[2] 吴 菡, 孙苏安. 乙醇固定时间在细胞蜡块技术中的应用[J]. 临床与实验病理学杂志, 2015,31(1):99-100.

[3] 钱金林, 王登山, 李林秋, 等. 烤片方法对不同组织类型切片皱褶产生的影响[J]. 临床与实验病理学杂志, 2016,32(11):1301-1303.

[4] 《乳腺癌HER2检测指南(2014版)》编写组.乳腺癌HER-2检测指南(2014版)[J]. 中华病理学杂志, 2014,43(4):262-267.

[5] Lv Q, Meng Z, Yu Y,etal. Molecular mechanisms and translational therapies for human epidermal Receptor 2 positive breast cancer[J]. Int J Mol Sci, 2016,17(12):e2095.

[6] 聂艳红, 刘 慧, 周卫宁, 等. 不同亚型乳腺癌中 p16 基因启动子甲基化[J]. 临床与实验病理学杂志, 2012,28(11):1202-1205.

[7] 步 宏, 杨文涛. 以标准化的乳腺癌HER2检测带动病理诊断质量的提高[J]. 中华病理学杂志, 2014,43(4):217-218.

[8] Rakha E A, Starczynski J, Lee A H,etal. The updated ASCO/CAP guideline recommendations for HER2 testing in the management of invasive breast cancer: a criticalreview of their implications for routine practice[J]. Histopathology, 2014,64(5):609-615.

广东省医学科学技术研究基金(A2017321)、广东省中山市卫生和计划生育局医学科研立项课题(2014J128)

南方医科大学附属中山博爱医院病理科，中山 528400

陈志强，男，副主任技师。E-mail: 765228687@qq.com

时间：2017-8-20 15:27 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.025.html

R 392.3

B

1001-7399(2017)08-0927-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.025

接受日期：2017-03-02