胃癌组织中Nupr1的表达及其临床意义

丁美玉 亓 超 姜相君*大连医科大学附属青岛市市立医院消化内二科(660) 普外科

胃癌组织中Nupr1的表达及其临床意义

丁美玉1亓 超2姜相君1*
大连医科大学附属青岛市市立医院消化内二科1(266011) 普外科2

背景：胃癌的发病率和死亡率在全球居高不下，因此亟需探索胃癌诊断和治疗的新靶点。核蛋白1(Nupr1)具有多种生物学功能，尤其是在恶性肿瘤发生、进展过程中的作用突出。目的：探讨Nupr1在胃癌中的表达情况及其临床意义。方法：利用实时荧光定量PCR检测72例胃癌组织及其配对癌旁组织中的Nupr1 mRNA表达，以蛋白质印迹法和免疫组化技术检测Nupr1蛋白表达及其细胞定位，分析Nupr1表达与胃癌临床病理特征的关系。结果：胃癌组织中Nupr1 mRNA和蛋白表达均显著高于癌旁组织(P<0.05)，两者表达变化趋势相一致。Nupr1蛋白主要表达于细胞质，细胞核内也可见少量表达。胃癌组织中的Nupr1 mRNA表达与肿瘤体积、分化程度、病理类型、Bormann分型、浸润深度、淋巴结转移、远处转移和TNM分期显著相关(P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤部位无明显相关性(P>0.05)。结论：Nupr1在胃癌组织中高表达并可能与肿瘤侵袭、转移、进展相关，可作为胃癌早期诊断和预后评估的新标记物，并可能成为胃癌治疗的潜在靶点。

胃肿瘤； 疾病恶化； 核蛋白类； 实时聚合酶链反应； 印迹法，蛋白质； 免疫组织化学

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，位列全球恶性肿瘤发病率的第4位，在我国的发病率和死亡率分别居于第2位和第3位[1-2]。目前胃癌的有效治疗手段有限，单纯手术治疗的总体生存率只有20%左右，放疗和化疗亦无明显生存优势[3]。因此，亟需探索诊断和治疗胃癌的新技术和新靶点。

核蛋白1(nuclear protein 1, Nupr1)又称p8或com1(candidate of metastasis-1)，具有核定位信号序列(nuclear localization sequence, NLS)，是一种肿瘤相关应激分子，最先是从急性胰腺炎大鼠的胰腺腺泡细胞中被克隆证实并命名[4-6]。Nupr1具有转录活性，已被证实在多种恶性肿瘤的发生、进展和转移过程中发挥重要作用[7]，但有关其在胃癌中的表达及其作用机制的研究鲜见。本研究旨在探讨Nupr1在胃癌中的表达情况及其临床意义，以期为胃癌的临床诊治提供新思路。

材料与方法

一、标本来源

收集2015年7月—2016年6月在大连医科大学附属青岛市市立医院普外科手术切除的胃癌组织标本(癌灶中央非坏死区域)72例及其配对癌旁组织标本(距癌组织边缘5 cm以上)72例，标本取下后立即置于RNA保存液中，-80 ℃保存，用于后续实验。所有癌组织标本均经2名资深病理科医师确诊为原发性胃癌。标本来源病例中男性56例，女性16例，年龄43～89岁，平均年龄(61.11±10.16)岁，中位年龄60岁；术前未接受任何抗肿瘤治疗，术中均行淋巴结清扫，临床资料完整。研究方案经青岛医学会伦理委员会批准，标本使用取得患者知情同意。

二、方法

1. 实时荧光定量PCR检测Nupr1 mRNA表达：将胃癌和癌旁组织充分研磨后，以总RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取总RNA，以逆转录试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]合成cDNA，以之为模板行实时荧光定量PCR。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，Nupr1引物序列：F 5’-GAC AGA CAA AGC GTT AGG AGA A-3’，R 5’-GGA GTC AGA GGT GAA GTG GG-3’；β-actin(内参)引物序列：F 5’-CTT AGT TGC GTT ACA CCC TTT CTT G-3’，R 5’-CTG TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-3’。反应体系含cDNA模板1 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、SYBR GREEN Master Mix 10 μL(北京索莱宝科技有限公司)，以双蒸水补足至20 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。每一样本均设3个复孔。采用2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。

2. 蛋白质印迹法检测Nupr1蛋白表达：以RIPA裂解液和PMSF裂解、抽提胃癌和癌旁组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。总蛋白上样，经SDS-PAGE电泳分离、转膜、封闭后，加入兔抗人Nupr1一抗(Abcam plc.，1∶500)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤后加入HRP标记的二抗羊抗兔IgG(1∶5 000)，室温孵育2 h，TBST洗涤后ECL化学发光试剂自显影，凝胶成像系统采集图像，以Gel-Pro Analyzer软件分析目的蛋白和内参蛋白条带光密度值，计算目的蛋白相对表达量。

3. 免疫组化染色检测Nupr1蛋白表达及其细胞定位：胃癌和癌旁组织病理蜡块4 μm连续切片，使用SP免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)行免疫组化染色。病理切片常规脱蜡、水化，高压抗原修复，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭，滴加Nupr1一抗(Proteintech Group，1∶150)，37 ℃孵育3 h，PBS洗涤后滴加生物素标记的二抗，37 ℃孵育15 min，PBS洗涤后滴加HRP标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min，PBS洗涤后DAB染色，自来水冲洗终止染色，苏木精复染，脱水、透明、封片，光学显微镜下观察。

结果判定：在细胞核或细胞质中观察到淡黄色至黄褐色颗粒为阳性细胞。于200倍视野下随机观察至少5个视野，采用半定量积分法进行免疫组化评分，总分为染色强度评分与阳性细胞率评分之积。染色强度评分：未染色视为阴性，计0分；淡黄色计1分；黄色计2分；黄褐色计3分。阳性细胞率评分：<10% 视为阴性，计0分；10%～25%计1分；26%～50%计2分；>50%计3分。总分0分为阴性(-)，1～3分为弱阳性(+)，4～6分为中等阳性(++)，>6 分为强阳性(+++)。由2名病理科主治医师独立阅片并进行判定，评分不一致时取均值。

三、统计学分析

结 果

一、Nupr1 mRNA表达

实时荧光定量PCR绘制的熔解曲线表明目的片段特异性扩增，阴性对照无扩增曲线，可排除污染因素影响。胃癌组织Nupr1 mRNA相对表达量为2.10±0.60，明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(t=15.499，P=0.000)。

二、Nupr1蛋白表达

蛋白质印迹法结果显示，胃癌组织Nupr1蛋白相对表达量为2.06±0.54，明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(t=16.531，P=0.000)(图1)。胃癌组织中Nupr1蛋白表达与其mRNA表达的变化趋势相一致，均显著高于癌旁组织。

1 Da=0.992 1 u

三、免疫组化染色

免疫组化染色结果显示，胃癌和癌旁组织中的Nupr1蛋白均主要表达于细胞质，细胞核内也可见少量表达(图2)。胃癌组织中Nupr1表达阴性、弱阳性、中等阳性和强阳性例数分别为8例、18例、20例和26例，阳性表达率为88.9%(64/72)；癌旁组织中Nupr1表达阴性、弱阳性、中等阳性和强阳性例数分别为57例、10例、5例和0例，阳性表达率为20.8%(15/72)。胃癌组织中的Nupr1表达明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=67.331，P=0.000)。

图2 胃癌和癌旁组织Nupr1蛋白表达(免疫组化染色)

四、胃癌组织Nupr1表达与胃癌临床病理特征的关系

统计学分析显示，胃癌组织中的Nupr1 mRNA表达与肿瘤体积、分化程度、病理类型、Bormann分型、浸润深度、淋巴结转移、远处转移和TNM分期显著相关(P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤部位无明显相关性(P>0.05)(表1)。

表1 胃癌组织Nupr1 mRNA表达与胃癌临床病理特征的关系

临床病理特征例数Nupr1mRNA相对表达量P值性别 男562．06±0．570．410 女162．21±0．71年龄 <60岁302．01±0．520．153 ≥60岁422．22±0．69肿瘤直径 <5cm582．03±0．610．046 ≥5cm142．38±0．46肿瘤部位 胃底112．14±0．780．944 胃体262．07±0．60 胃窦352．10±0．55分化程度 高/中分化301．93±0．530．041 低分化422．22±0．62病理类型 管状/乳头状腺癌561．98±0．570．020 印戒细胞癌/黏液腺癌162．49±0．53Bormann分型 息肉型/局限溃疡型211．79±0．410．040 浸润溃疡型/弥漫浸润型512．22±0．63T分期 T1+T2251．77±0．480．000 T3+T4472．27±0．59N分期 N0+N1491．94±0．560．010 N2+N3232．42±0．57远处转移 无672．05±0．580．027 有52．66±0．56TNM分期 Ⅰ+Ⅱ381．72±0．330．010 Ⅲ+Ⅳ342．52±0．54

讨 论

胃癌因具有癌细胞增殖快、转移能力强的特点，致使很多患者在确诊时已处于疾病晚期，50岁以上的患者5年生存率不超过28%[8]。近年关于胃癌病因和治疗方面的研究已取得较大进展，然而目前临床治疗仍无法达到肿瘤病变完全缓解的目标，因此需要探索新的治疗靶点以指导胃癌的临床治疗。

机体对于微环境改变如缺氧、损伤、血清饥饿等可产生相应的细胞应激反应，从而适应环境，保证细胞正常生长和功能。人类Nupr1基因定位于染色体16p11.2，其编码蛋白是一个广泛表达的应激相关分子，生化特征类似于高迁移率族蛋白(high mobility group, HMG)[9]。Nupr1具有广泛的生物学功能，包括抗炎[10]、细胞周期调控[11]、自噬[12]、抑制细胞凋亡[13]等，其介导的细胞应激反应是肿瘤形成的重要因素[14]。越来越多的研究表明，Nupr1在多种恶性肿瘤组织中与正常组织相比存在差异表达，包括胰腺癌[15]、肝细胞癌[16-17]、乳腺癌[18]、结直肠癌[19]、非小细胞肺癌[20]、口腔鳞状细胞癌[21]、前列腺癌[22-23]、甲状腺乳头状癌[24]等，参与调控肿瘤发生和进展。Nupr1在肿瘤中的作用呈双向性，既可表现为促进肿瘤生长、增强肿瘤侵袭、转移能力，亦可能对肿瘤进展发挥抑制作用，如乳腺癌中Nupr1低表达与肿瘤转移、复发相关[18]；进展期结直肠癌中的Nupr1表达水平较早期结直肠癌显著降低[19]；前列腺癌中的Nupr1表达与肿瘤细胞生长及其侵袭性呈负相关，发挥抑癌作用[22-23]。此外，Nupr1还参与肿瘤耐药性的产生，如胰腺导管腺癌对吉西他滨的多重耐药与Nupr1参与的应激反应依赖性信号通路有关[25]。

鉴于Nupr1在不同组织以及同一组织不同细胞定位中的表达量不尽相同，本研究利用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法和免疫组化染色分别检测了胃癌和癌旁组织中Nupr1在基因和蛋白水平的表达及其细胞定位，结果显示胃癌组织中Nupr1 mRNA和蛋白表达均显著高于癌旁组织，两者的表达变化趋势相一致，提示胃癌和癌旁组织中的Nupr1表达水平在基因转录阶段已存在差异，在转录和翻译过程中保持相对稳定。以上研究结果表明，Nupr1可能参与了胃癌的发生、进展过程。

本研究进一步探讨了Nupr1表达与胃癌临床病理特征的关系，发现胃癌组织中的Nupr1 mRNA表达与肿瘤体积、分化程度、病理类型、Bormann分型、浸润深度、淋巴结转移、远处转移和TNM分期显著相关，肿瘤体积大、低分化、浸润深、存在淋巴结和远处转移、TNM分期较晚的患者，Nupr1表达显著增高，与既往研究结果相似[26]。基于以上结果可初步推测，Nupr1高表达与胃癌进展相关，提示患者的不良预后。

尽管Nupr1蛋白含有一个典型的NLS序列，是一种小分子核蛋白，但其细胞定位可因组织类型和细胞生长状态不同而发生改变。研究发现一些肿瘤组织如结直肠癌[19]、低分化甲状腺乳头状癌[24]中的Nupr1蛋白可发生明显的细胞质转位，此种细胞 定位改变可能受Nupr1 NSL序列乙酰化的调节[27]。本研究免疫组化染色显示胃癌和癌旁组织中的Nupr1蛋白均发生明显的细胞质转位，但细胞核内也可见少量表达，该定位特点与邢军等[26]的研究发现Nupr1蛋白在胃癌和癌旁组织中的表达均多在细胞核内相反。Nupr1在胃癌细胞中的作用部位及其机制仍有待进一步研究。

综上所述， Nupr1在胃癌组织中高表达并可能与肿瘤进展相关，可作为胃癌早期诊断和预后评估的新标记物。Lopez等[28]发现了Nupr1的同源蛋白Nupr1L，后者作为一种新的p53诱导基因，可在转录水平负向调控Nupr1表达。在胃癌的临床治疗过程中，如能有效抑制Nupr1表达，或许能延缓胃癌进展，改善患者预后，因此Nupr1有望成为胃癌的潜在治疗靶点。Nupr1参与胃癌发生、进展、侵袭、转移的作用机制有待进一步研究加以阐明。

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(2017-02-03收稿；2017-03-22修回)

Expression of Nupr1 in Gastric Cancer and its Clinical Significance

DINGMeiyu1,QIChao2,JIANGXiangjun1.
1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofGeneralSurgery,QingdaoMunicipalHospital,DalianMedicalUniversity,Qingdao,ShandongProvince(266011)

JIANG Xiangjun, Email: drjxj@163.com

Stomach Neoplasms; Disease Progression; Nucleoproteins; Real-Time Polymerase Chain Reaction; Blotting, Western; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.08.004

*本文通信作者，Email: drjxj@163.com

Background: The morbidity and mortality of gastric cancer remain high worldwide, and it is urgent to explore new targets for the diagnosis and treatment of gastric cancer. Nuclear protein 1 (Nupr1) has a variety of biological functions, especially in the tumorigenesis and development of the malignancies. Aims: To investigate the expression and clinical significance of Nupr1 in gastric cancer. Methods: Quantitative RT-PCR was used to determine the mRNA expression of Nupr1 in 72 cases of gastric cancerous tissue and the paired paracancerous tissue. Western blotting and immunohisto-chemistry were employed to detect the protein expression and cellular localization of Nupr1. The correlation of Nupr1 with the clinicopathological characteristics of gastric cancer was analyzed. Results: Expressions of Nupr1 mRNA and protein in gastric cancer were both significantly higher than those in paracancerous tissue (P<0.05), and their expressions were coincident. Nupr1 protein was expressed mainly in cytoplasm, and the nuclear expression was reduced. Expression of Nupr1 mRNA in gastric cancer was significantly correlated with tumor size, differentiation, pathological type, Bormann’s classification, depth of invasion, lymph node and distant metastases and TNM staging (P<0.05), and was not correlated with gender, age and site of tumor (P>0.05). Conclusions: Nupr1 is overexpressed and correlated with invasion, metastasis and progression of gastric cancer. It can be used as a novel biomarker for early diagnosis and prognosis evaluation, and as a potential target for treatment of gastric cancer.