谷氨酰胺治疗心肌缺血再灌注损伤的效果与机制分析

潘泽意 徐燕燕 徐晓艳 罗向红

谷氨酰胺治疗心肌缺血再灌注损伤的效果与机制分析

潘泽意 徐燕燕 徐晓艳 罗向红

目的 探讨谷氨酰胺治疗心肌缺血再灌注损伤的效果与机制。方法 研究时间为2015年2～10月。选择清洁级SPF大鼠48只，随机分为假手术组、缺血再灌注组和谷氨酰胺组，每组16只。建立心肌缺血再灌注损伤后，谷氨酰胺组给予腹腔注射谷氨酰胺治疗。观察三组大鼠心功能及炎症因子的表达变化情况。结果 缺血再灌注组和谷氨酰胺组都顺利建立心肌缺血再灌注损伤模型，表现为抬高的ST段逐步恢复，MAP逐步恢复，左心室颜色转红；同时心功能无明显变化，提示谷氨酰胺对心脏无明显毒性。三组心率（HR）在缺血前无明显差异，但缺血再灌注组再灌注后有下降趋势，而再灌注30 min后谷氨酰胺组HR较缺血再灌注组升高（P＜0.05）。假手术组给药前后MAP无明显变化，缺血再灌注组及谷氨酰胺组在给药后出现轻度下降，但未见统计学差异（P＞0.05）。谷氨酰胺组再灌30min的TNF-α和IL-6含量［（234.22±74.91）μg/ml和（33.45±19.11）μg/ml］均明显低于缺血再灌注组［（400.33±56.09）μg/ml和（67.29±12.22）μg/ml］（P＜0.05）；与假手术组比较未见统计学差异（P＞0.05）。结论 谷氨酰胺可以对抗缺血再灌注损伤引起的心肌损伤，发挥心脏保护作用，其机制可能与抑制炎症反应有关。

谷氨酰胺； 心肌缺血再灌注损伤； 炎症因子； 心脏保护作用

当前心血管疾病特别是心肌梗死在临床上越来越多，溶栓及经皮冠状动脉介入治疗可有效恢复缺血心肌的血流灌注，但是也容易出现心肌缺血再灌注损伤，导致心肌舒缩功能障碍、代谢异常、心律失常等，直接影响患者的预后[1,2]。心肌缺血再灌注诱发肺损伤的详细机制目前尚未完全阐明，其中自由基导致大量细胞因子的产生和各种信号通路的激活，在心肌缺血再灌注引起的早期心肌损伤发生发展中起着重要作用[3,4]。谷氨酰胺是人体内一种重要的游离氨基酸，在维持机体酸碱平衡、调节机体免疫功能等方面发挥重要作用。文献报道，谷氨酰胺能够通过增加肠道内超氧化物歧化酶（SOD）活性降低肠道缺血再灌注损伤，也能改善氧化还原状态，从而降低肝脏缺血再灌注损伤[5,6]。相关研究证实，谷氨酰胺对缺血再灌注心肌具有保护作用，能改善心肌能量代谢，因而适合作为心肌细胞的保护剂用于缺血性心血管疾病的急救[7,8]。本研究通过动物模型分析谷氨酰胺治疗心肌缺血再灌注损伤的效果与机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 研究时间为2015年2～10月。动物实验得到动物伦理和福利委员会批准，所有操作均按照《实验动物管理条例（1996）》的相关规定进行。选择清洁级SPF大鼠48只（上海斯莱克实验动物公司提供，动物合格证号 NCDWNO：2012-0015），体质量150～220 g，雌雄各24只。将大鼠分笼饲养于清洁的笼具中，室温25℃左右，自由进食和饮水，相对湿度60%左右。由我院动物中心给予标准化普通饲料，每2 d更换3次垫料和笼子。

1.2 实验方法 将48只大鼠随机分为3组，假手术组（NC group）、缺血再灌注组（IR group）和谷氨酰胺组（Glu group），每组16只。建立心肌缺血再灌注损伤模型：将大鼠用25%乌拉糖（1 g/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上，监测生命体征。所有手术器械都经过灭菌处理。碘伏消毒颈胸部，剪除大鼠颈部及胸部被毛，纵行剪开颈部皮肤1.5～2.0 cm，钝性分离皮下组织及肌肉，在气管旁、胸锁乳突肌前缘分离出右侧颈动脉，结扎动脉远心端，记录收缩压（SBP）及舒张压（DBP）。提起气管后缝合线，行气管插管，根据大鼠表现调节呼吸机的呼吸频率、呼吸比及潮气量。在胸骨左缘3 mm处纵向剪开胸部皮肤约4 cm，暴露肋骨及肋间肌。贴胸壁撑开肋间隙，纵向夹闭、松开肋骨后剪断第2、3、4根肋骨，剪开心包，暴露心脏。从左心耳下缘1 mm处水平进针，经LAD下，于肺动脉圆锥旁出针，形成一个活结，水平拉紧，造成心肌缺血；然后放松活结使心肌恢复灌注，执行心肌缺血30min再灌注2 h程序。谷氨酰胺组大鼠麻醉后，经腹腔注射药物（谷氨酰胺原浓度0.2 g/ml，使用时5倍体积稀释至0.04 g/ml），观察并记录心电图及血压变化，30 min后进行开胸手术，也执行心肌缺血30 min再灌注2 h程序。

1.3 观察指标 ①建模成功情况：心肌缺血标志为ST段进行性抬高或降低，平均动脉压（MAP）下降或升高，左心室发绀。心肌缺血再灌注损伤标志为抬高的ST段逐步恢复，MAP逐步恢复，左心室颜色转红。②心率和平均动脉压测定：在给药前、给药5min、再灌30 min，用生物机能实验系统记录与计算HR及MAP值的变化。④流出液炎症因子的检测：在大鼠再灌30 min收集冠脉流出液，全自动生化分析仪检测流出液中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素（IL）-6含量，按试剂盒说明书操作。

1.4 统计学方法 采用SPSS 14.0软件进行统计学处理。计量资料用±s表示，两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数数据采用百分比表示，对比采用卡方分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 建模情况 经过观察，缺血再灌注组和谷氨酰胺组都顺利建立心肌缺血再灌注损伤模型，表现为抬高的ST段逐步恢复，MAP逐步恢复，左心室颜色转红，同时心功能无明显变化，提示谷氨酰胺对心脏无明显毒性。

2.2 心率变化情况对比 三组HR在缺血前无明显差异，但缺血再灌注组再灌注后有下降趋势，而再灌注30 min后谷氨酰胺组HR较缺血再灌注组升高（P＜0.05）。见表1。

2.3 平均动脉压变化情况对比 假手术组给药前后MAP无明显变化，缺血再灌注组与谷氨酰胺组在给药后出现轻度下降，但未见统计学差异（P＞0.05）。见表2。

表1 三组离体心脏HR比较（±s）

表1 三组离体心脏HR比较（±s）

注：HR：心率。与缺血再灌注组对比，aP＜0.05

组别 例数假手术组 16 448.53±34.20 441.98±22.87 445.20±24.89缺血再灌注组 16 449.09±22.14 345.11±31.45 334.98±33.22谷氨酰胺组 16 447.87±31.78 351.20±26.11 431.89±21.42aHR（次/min）给药前 给药5min 再灌30min

表2 三组离体心脏MAP比较（±s）

表2 三组离体心脏MAP比较（±s）

注：MAP：平均动脉压。1mm Hg=0.133 kPa

组别 例数假手术组 16 126.34±5.87 123.98±9.10 119.87±4.24缺血再灌注组 16 123.13±7.13 114.20±9.42 116.30±7.46谷氨酰胺组 16 124.98±6.34 121.89±10.87 120.87±7.11 MAP（mm Hg）给药前 给药5min 再灌30min

2.4 流出液炎症因子含量比较 经过检测，谷氨酰胺组再灌 30 min时 TNF-α和 IL-6含量［（234.22±74.91）μg/ml和（33.45±19.11）μg/ml］均明显低于缺血再灌注组［（400.33±56.09）μg/m l和（67.29±12.22）μg/ml］（P＜0.05），而与假手术组比较未见统计学差异（P＞0.05），见表3。

表3 三组流出液炎症因子的比较（±s）

表3 三组流出液炎症因子的比较（±s）

注：TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-6：白细胞介素-6。与缺血再灌注组对比，aP＜0.05

组别 例数 TNF-α（μg/m l） IL-6（μg/ml）假手术组 16 210.35±56.12 34.12±16.93缺血再灌注组 16 400.33±56.09 67.29±12.22谷氨酰胺组 16 234.22±74.91a 33.45±19.11a

3 讨论

当前我国的心肌梗死发病率不断升高，且发病年龄有年轻化的趋势。心肌梗死发生的病理基础是冠状动脉的部分或完全阻塞造成心肌的缺血缺氧。随着溶栓疗法、动脉搭桥术等方法的建立和推广，明显减轻了细胞缺血性损伤，心肌组织重新获得血液供应，但是也带来了一定的再灌注损伤，直接影响患者的预后[9,10]。

心肌缺血再灌注损伤是指缺血心肌在恢复血液再灌注后，功能代谢障碍及结构破坏反而加重的现象，主要机制为自由基增多、微血管损伤、细胞内钙超载等[11]。当前研究显示，一些能够减轻氧化应激的治疗方法均能不同程度地改善心肌缺血患者的预后，提示心肌缺血疾病的发生和进展与心肌氧化应激的变化相关。在重症疾病中，氧化应激状态是由于活性氧的增加与天然抗氧化物质产生减少的平衡失调而引起[12]。谷氨酰胺作为谷胱甘肽的前体之一，在心肌缺血再灌注心肌和组织中均有明显下降，提示谷氨酰胺可能具有重要的保护性作用[13]。谷氨酰胺可通过保持和增加组织细胞内还原型谷胱苷肽的储备，有助于受损细胞的修复和功能恢复，从而保护和减轻细胞免受氧自由基介导的损伤，提高机体抗氧化能力[14,15]。本研究显示，三组HR在缺血前无明显差异，但缺血再灌注组再灌注后有下降趋势，而再灌注30 min后谷氨酰胺组HR较缺血再灌注组升高（P＜0.05），表明谷氨酰胺能够明显改善缺血再灌注损伤所导致的心功能降低，发挥心脏保护作用。

谷氨酰胺作为“条件必需氨基酸”，在心肌缺血再灌注损伤中发挥了重要的辅助作用。谷氨酰胺可通过减少氧自由基生成，维护心肌细胞能量和离子稳态，抑制心肌细胞膜脂质过氧化进而维持正常心肌电活动[16]。已有研究表明，谷氨酰胺能够抑制烧伤所致心功能下降，能显著升高失血后平均动脉压，而谷氨酰胺对缺血再灌注所损伤心肌是否具有保护作用还未见报道[17]。本研究显示，假手术组给药前后MAP无明显变化，缺血再灌注组和谷氨酰胺组在给药后MAP出现轻度下降，但未见统计学差异（P＞0.05），不过谷氨酰胺组则呈现稳健的回复趋势，体现出更好的保护作用。

心肌缺血再灌注损伤是一种全身系统炎性疾病的肺部表现，其发生机制目前尚不明确。诸多因素可激活一系列不同的炎症细胞，可触发失控性或过度的炎性反应，并进一步激发其他炎症细胞，释放大量炎症细胞因子，明显放大机体损伤信号，出现炎症瀑布效应，最后出现器官严重损伤。研究显示，心肌缺血再灌注后最早激活的是巨噬细胞，激活的巨噬细胞释放一系列前炎性因子，如TNF-α和IL-6等[18]。有研究表明，谷氨酰胺和丙氨酰谷氨酰胺能够诱导炎症组织内谷胱甘肽的累积，从而减轻炎症反应并促进组织恢复[19]。本研究显示，谷氨酰胺组再灌30 min的TNF-α和IL-6含量均明显低于缺血再灌注组（P＜0.05），而与假手术组比较均未见统计学差异（P＞0.05），主要在于谷氨酰胺可以增强心肌对非应激性手术过程带来的损伤的耐受性，进而能减轻炎症反应。

总之，谷氨酰胺可以对抗缺血再灌注损伤引起的心肌损伤，发挥心脏保护作用，其机制可能与抑制炎症反应有关。

［1］李凯，崔永春，张宏，等.谷氨酰胺对糖尿病心肌缺血再灌注中线粒体的保护性作用.中国循环杂志，2015，30：22-23.

［2］张颖，孙畅，陈文华，等.尼可地尔、谷氨酰胺、美托洛尔单独及联合使用抗大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用.中国医院药学杂志，2014，34：337-342.

［3］Tüfek A，Tokgoz O，Aliosmanoglu I，et al.The protective effects of dexmedetomidine on the liver and remote organs against hepatic ischemia reperfusion injury in rats.Int J Surg，2013，11：96-100.

［4］许华山，陈胜喜，罗万俊，等.应激对缺血预适应心肌细胞凋亡的影响.中南大学学报：医学版，2014，39：477-482.

［5］Zhang H，Cui YC，Li K，et al.Glutamine protects cardiomyocytes from hypoxia/reoxygenation injury under high glucose conditions through inhibition of the transforming growth factor-β1-Smad3 pathway.Arch Biochem Biophys，2016，3：43-50.

［6］刘新育，顾剑民，薛松.NF-κB与心肌缺血再灌注损伤的研究现状及展望.中华胸心血管外科杂志，2016，32：55-58.

［7］郑俊华，唐浩然，景丽英，等.心肌缺血再灌注损伤中TNF-α血清水平表达对心肌收缩功能影响的实验研究.中西医结合心脑血管病杂志，2015，10：1169-1171.

［8］Shih YM，Shih JM，Pai MH，et al.Glutamine Administration After Sublethal Lower Limb Ischemia Reduces Inflammatory Reaction and Offers Organ Protection in Ischemia/Reperfusion Injury.JPEN JParenter Enteral Nutr，2015，2：114-116.

［9］黄星月，胡钢英，黄婷婷，等.早期脑利钠肽后处理对心肌缺血再灌注损伤和高迁移率族蛋白1表达的影响.中西医结合心脑血管病杂志，2015，10：55-57.

［10］Berger HR，Morken TS，Vettukattil R，et al.No improvement of neuronal metabolism in the reperfusion phase with melatonin treatment after hypoxic-ischemic brain injury in the neonatal rat.JNeurochem，2015，11：114-116.

［11］张宝惠，张剑勇，薛临生.依托咪酯对大鼠心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的影响.实用医技杂志，2012，19：1203-1204.

［12］李凯，崔永春，张宏，等.谷氨酰胺通过抑制氧化应激减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤.中国循环杂志，2015，30：22-22.

［13］Crafts TD，Hunsberger EB，Jensen AR，et al.Direct peritoneal resuscitation improves survival and decreases inflammation after intestinal ischemia and reperfusion injury.J Surg Res，2015，199：428-434.

［14］马欣，李玉成.谷氨酰胺与心肌缺血再灌注损伤.中国动脉硬化杂志，2007，15：873-875.

［15］WangAL，NiuQ，ShiN，etal.Glutamineameliorates intestinalischemia-reperfusionInjuryinratsbyactivatingthe Nrf2/Aresignalingpathway.IntJClinExpPathol，2015，8：7896-7904.

［16］刘月江，李斌，张宝岭，等.术前输注谷氨酰胺对体外循环下心脏手术患者的心肌保护效果.中华麻醉学杂志，2015，35：279-282.

［17］SmithMA，HibinoM，FalcioneBA，etal.Immunosuppressive aspects ofanalgesics and sedatives used in mechanically ventilated patients:an underappreciated risk factorforthe developmentofventilator-associatedpneumoniaincriticallyill patients.AnnPharmacother，2014，48：77-85.

［18］陈文华，孙畅，张颖，等.尼可地尔、谷氨酰胺、美托洛尔单独及合用对大鼠心肌缺血/再灌注损伤后心肌细胞抗凋亡和HSP70的影响.中国药理学通报，2014，9：1242-1246.

［19］PaiMH，ShihYM，ShihJM，etal.GlutamineModulates Changes in Intestinal Intraepithelial γδT -Lymphocyte ExpressionsinMiceWithIschemia/ReperfusionInjury.Shock，2015，44：77-82.（收稿日期：2016-07-13）

The effects and mechanism of glutam ine in the treatment ofm yocardial ischem ia reperfusion injury

PAN Ze-yi＊，XU Yan-yan，XU Xiao-yan，et al.＊Department of Surgery，Guangshui Second People′s Hospital of Hubei，Guangshui 432721，China

ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of glutamine in the treatment of myocardial ischemia and reperfusion injury.MethodsThe study time were from February 2015 to October 2015，48 SPF clean grade Rats were completely randomized the NC group（n=16），IR group（n=16）and Glu group（n=16）.After were establishment of myocardial ischemia and reperfusion injury，the Glu group were

intraperitoneal injection of glutamyl amine treatment.The expression changes of the three groups of cardiac function and inflammatory factors were observed.ResultsThe myocardial ischemia reperfusion injury models were successfully established in the IR group and Glu group.There were no significant difference in HR compared among the three groups before and after ischemia，but the IR group were showed decreasing trend after reperfusion，and the HR in the Glu group were higher than that in the IR group after reperfusion in reperfusion 30 min（P＜0.05）.There were no significant change in MAP before and after administration compared among the three groups，and there were a slight decrease in the IR group and Glu group after administration，but there were no significant difference compared between the groups（P＞0.05）.The TNF-αand IL-6 levels in the reperfusion 30 min in the Glu group［（234.22±74.91）μg/ml and（33.45±19.11）μg/ml］were significantly lower than that in IR group［（400.33±56.09）μg/ml and（67.29± 12.22）μg/ml］（P＜0.05），but there was no significant difference compared between the Glu group and the NC group（P＞0.05）.ConclusionGlutamine can protect againstmyocardial injury induced by ischemia and reperfusion injury，and itsmechanism may be related to the inhibition of inflammatory reaction.

Glutamine； Myocardial ischemia reperfusion injury； Inflammatory factors； Heart protectio

2014年湖北教育厅课题（项目编号：B2014045）

432721 湖北省广水市，广水市第二人民医院外科（潘泽意），内科（徐燕燕）；武汉科技大学临床学院内科（徐晓艳）；湖北医药学院（罗向红）

10．3969/j．issn．1672－5301．2017．01．025

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2017）01-0089-05