亚硝酰氢对心力衰竭大鼠心脏保护作用的研究

徐继尧 郭彦青 杨晋静 柴晓红 王日军 庞工力 王婧 王宁 张昊洲 王敬萍

亚硝酰氢对心力衰竭大鼠心脏保护作用的研究

徐继尧 郭彦青 杨晋静 柴晓红 王日军 庞工力 王婧 王宁 张昊洲 王敬萍

目的 探讨亚硝酰氢对心力衰竭大鼠心脏是否有保护作用。方法 选取50只雄性Wistar大鼠，从中随机抽取42只采用结扎左冠状动脉前降支方法制作心肌梗死后心力衰竭模型，剩余8只作为假手术组（Sham组，n=8）。术后3 d手术组大鼠存活17只，随机分为心力衰竭对照组（HF组，n=8）和亚硝酰氢治疗组（HNO组，n=9）。术后第3天开始给予HNO组大鼠腹腔注射亚硝酰氢供体Angeli′s salt，HF组及Sham组均给予等量生理盐水；4周后用ELISA法检测大鼠外周血N末端B型利钠肽（NT-proBNP）水平，超声心动图检测大鼠心功能，左心压力导管检测大鼠血流动力学改变，最后处死大鼠，计算心体指数。结果 术后4周HNO治疗组大鼠与HF组相比，NT-ProBNP、左心室舒张末压（LVEDP）明显降低［（385.65±43.50）pg/ml比（496.13±52.80）pg/ml，P＜0.01；（17.49±2.04）mm Hg比（21.19±1.91）mm Hg，P＜0.05］，左心室射血分数（LVEF）［（52.88±5.46）%比（39.71±3.64）%，P＜0.01］、左心室短轴收缩率（LVFS）［（23.75±3.11）%比（16.57±1.72）%，P＜0.01］、左心室内压力最大上升速率（+dp/dt）［（3029.13±634.12）mm Hg/s比（2347.43±451.38）mm Hg/s，P＜0.05］、左心室内压力最大下降速率（-dp/dt）［（2896.50±642.66）mm Hg/s比（2169.29±433.17）mm Hg/s，P＜0.05］明显增加，心体指数（HW/BW）、左心室舒张末内径（LVEDd）、左心室收缩压（LVSP）无明显差异［（2.97± 0.17）g/kg比（2.98±0.16）g/kg，（7.19±0.87）mm比（7.66±0.84）mm，（131.38±9.47）mm Hg比（130.57±11.46）mm Hg，P均＞0.05］。结论 亚硝酰氢可以增强心力衰竭大鼠心脏功能，改善血流动力学，降低外周血NT-ProBNP水平，对心力衰竭大鼠心脏起保护作用。

心力衰竭； 亚硝酰氢； 压力导管； 血流动力学

急性心肌梗死（AMI）是各种原因引起的冠状动脉狭窄或闭塞，导致冠脉有效循环血量减少或心肌氧供需矛盾使相应区域心肌缺血、缺氧性损害的一类疾病[1]。如果不及时治疗或治疗不当，将导致病变部位心肌细胞变性、凋亡或坏死，最终导致心脏舒缩功能障碍，不能满足机体生理需求，出现心力衰竭（heart failure，HF），也是导致患者死亡的重要原因之一。目前HF的药物治疗虽可以改善患者的急性症状，但对其长期预后却不是十分理想[2]。近期研究发现，亚硝酰氢（Nitroxyl，HNO）可改善心脏收缩和舒张功能，扩张容量血管和阻力血管[3]，对心脏起保护作用。但这些研究大都局限于离体组织[4]或细胞实验。HNO是否可以在生物体内稳定存在并发挥心脏保护作用，是否会影响生物体的心率、血压变化仍未得到进一步证实。本实验使用HNO供体Angeli′s salt[5]干预急性心肌梗死后心力衰竭大鼠，探讨HNO对心衰大鼠心脏是否具有保护作用。

1 材料与方法

1.1 急性心肌梗死后心力衰竭模型制备 将大鼠称重后用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉，仰卧固定，颈前区及胸前区备皮，连接心电监护，行气管插管，呼吸机辅助呼吸（潮气量10 ml，呼吸频率60次/min，呼吸比1∶1）。开胸，用7/0无创缝合线在左心耳下方0.5～1.0 mm处结扎心脏左冠状动脉前降支（LAD），结扎当时ST段明显抬高（≥1/2R波），结扎远端心脏变苍白，逐层关胸，将大鼠放至37℃恒温箱中自然苏醒。

1.2 实验分组及药物干预 选取50只健康、雄性Wistar大鼠（购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，6～8周龄，体重160～180 g，健康编号0011896），其中42只制作心肌梗死后心力衰竭模型，术后3 d存活17只，随机分为心衰对照组（HF组，n=8）和亚硝酰氢治疗组（HNO组，n=9）；其余8只作为假手术组（Sham组，n=8，只予左心耳下方穿一缝合线，不结扎）。术后第3天开始给予HNO组大鼠HNO供体Angeli′s salt（AS，Cayman，USA）0.2 mg/kg[5]腹腔注射，2次/d；HF组和Sham组均给予等量生理盐水；术后4周结束实验。实验中HF组和HNO组大鼠各死亡1只，均死于心衰。

1.3 N末端B型利钠肽（NT-proBNP）测定 按ELISA试剂盒（ADL，USA）操作说明书测定。术后4周从鼠尾静脉抽取静脉血，3000 rpm离心10 min，收集血清；将血清样品与不同浓度的标准品加入酶标板中，再加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体，37℃温育1 h，洗板5次，加入底物A、B，37℃避光孵育15min，加入终止液，用450 nm波长检测各孔OD值，绘制标准曲线，计算样品中NT-proBNP含量。

1.4 超声心动图检测心功能指标 所有大鼠均于术后4周行超声心动图检查。检测前用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧固定，胸前区备皮；用小动物超声探头（探头频率10 MHz，图像深度2.5 cm）取胸骨旁左室长轴及短轴切面进行测量，测量参数包括左心室舒张末期内径（LVEDd）、左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴收缩率（LVFS），每个指标取3个心动周期的平均值。

1.5 左心压力导管检测血流动力学指标 用BL-410生物转换系统检测血流动力学各项指标。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，颈部备皮，分离右颈内动脉，用连有压力换能器的导管经右颈内动脉插入左心室，待出现稳定的压力波形时记录大鼠左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末压（LVEDP）、左心室内压力最大上升速率（+dp/dt）、左心室内压力最大下降速率（-dp/dt），每个指标用3个不同时刻的平均值代替。

1.6 心体指数计算 处死大鼠前称取其体重（BW），然后迅速处死大鼠，取出心脏，生理盐水洗净残血，准确称取心脏重量（HW）。心体指数=HW/ BW。

1.7 统计学方法 实验数据采用SPSS 13.0统计学软件分析。计量资料用±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组间NT-proBNP及心体指数检测结果 与Sham组相比，HF组NT-proBNP明显增加（P＜0.01），而HW、BW及HW/BW均无明显差异（P＞0.05）；与HF组相比，HNO治疗组NT-proBNP明显降低（P＜0.01），HW、BW、HW/BW亦无明显差异（P＞0.05）。见表1。

表1 大鼠NT-proBNP、心体指数比较（±s）

表1 大鼠NT-proBNP、心体指数比较（±s）

注：NT-proBNP：N末端B型利钠肽；HW：心脏重量；BW：体重；HW/BW：心体指数。与Sham组相比，aP＜0.01；与HF组相比，bP＜0.01

组别 NT-proBNP（pg/m l）HW（g）BW（g）HW/BW（g/kg）Sham组 148.04±19.94 0.73±0.04 242.75±7.50 3.01±0.10 HF组 496.13±52.80a 0.72±0.05 241.14±6.01 2.98±0.16 HNO治疗组 385.65±43.50b 0.73±0.05 244.25±7.96 2.97±0.17

2.2 超声心动图检测结果 与Sham组相比，HF组LVEF、LVFS明显降低（P＜0.01），LVEDd明显增加（P＜0.01）；与HF组相比，HNO治疗组LVEF、LVFS明显增加（P＜0.01），LVEDd无明显差异（P＞0.05）。见表2。

表2 大鼠超声心动图各项指标比较（±s）

表2 大鼠超声心动图各项指标比较（±s）

注：LVEDd：左心室舒张末期内径；LVEF：左心室射血分数；LVFS：左心室短轴收缩率。与Sham组相比，aP＜0.01；与HF组相比，bP＜0.01

组别 L V E D d（m m） L V E F（%） L V F S（%）S h a m组 5 . 0 9 ± 0 . 6 6 8 1 . 2 5 ± 1 0 . 9 9 4 6 . 2 5 ± 1 2 . 1 2 H F组 7 . 6 6 ± 0 . 8 4a 3 9 . 7 1 ± 3 . 6 4a 1 6 . 5 7 ± 1 . 7 2aH N O治疗组 7 . 1 9 ± 0 . 8 7 5 2 . 8 8 ± 5 . 4 6b 2 3 . 7 5 ± 3 . 1 1b

2.3 血流动力学检测结果 与Sham组相比，HF组LVEDP明显增加（P＜0.01），+dp/dt、-dp/dt明显减低（P＜0.01），LVSP无明显差异（P＞0.05）；与HF组相比，HNO治疗组LVEDP明显减低（P＜0.05），+dp/dt、-dp/dt明显增加（P＜0.05），LVSP无明显差异（P＞0.05）。见表3。

表3 大鼠血流动力学各项指标比较（±s）

表3 大鼠血流动力学各项指标比较（±s）

注：LVSP：左心室收缩压；LVEDP：左心室舒张末压；+dp/dt：左心室内压力最大上升速率；-dp/dt：左心室内压力最大下降速率。与Sham组相比，aP＜0.01；与HF组相比，bP＜0.05

组别 LVSP（mm Hg）LVEDP（mm Hg）+dp/dt（mm Hg/s）-dp/dt（mm Hg/s）Sham组 139.13±6.75 7.26±0.70 4170.50±646.82 3929.25±557.97 HF组 130.57±11.46 21.19±1.91a2347.43±451.38a2169.29±433.17aHNO治疗组 131.38±9.47 17.49±2.04b3029.13±634.12b2896.50±642.66b

3 讨论

HNO被认为是一氧化氮的单电子还原产物，与其他氮氧化物相比具有一些特殊的化学性质[6]。它既可以作为还原剂与一些重要蛋白质的金属反应中心结合，改变其生物学活性；又可以作为氧化剂与具有半胱氨酸活性的巯基反应，将其氧化成N-羟化亚磺酰胺（RSNHOH）或形成二硫键改变蛋白质构象，导致蛋白质功能的变化。心肌细胞中的一些蛋白质，如受磷蛋白、肌浆网钙泵、雷诺丁受体、肌丝蛋白等均含有半胱氨酸活性巯基位点，HNO可改变这些蛋白质的空间构象改善心肌细胞功能[7]。离体心脏灌流实验[8]表明，HNO供体AS可呈剂量依赖性增加大鼠心脏冠状动脉血流量，有效减轻心脏负荷，同时改善左心室收缩及舒张功能。

本实验采用结扎左冠状动脉前降支（LAD）的方法制作心肌梗死后心力衰竭模型。该方法需在气管插管、呼吸机辅助呼吸的条件下打开胸腔，迅速、准确地结扎LAD。术后大鼠成活率较低，但成模率可达100%，且造模所需时间短，模型稳定、可靠，术后大鼠心衰程度相当。更重要的是心梗后心力衰竭模型对外周血管阻力影响相对较小，可在不改变外周血管阻力的条件下研究HNO对HF大鼠心血管功能的影响，增加实验的说服力。

实验中手术组大鼠心腔明显大于Sham组，射血分数明显降低，说明手术组大鼠出现了明显的心衰，模型制作成功。经过HNO治疗4周后LVEF、LVFS明显改善，初步证明HNO可以改善心力衰竭大鼠心脏功能，但对心衰大鼠LVEDd没有影响，可能与我们的实验周期短或与HNO的药理作用有限有关。

为了进一步探讨HNO对衰竭心脏的保护作用，本实验采用左心压力导管对所有大鼠进行血流动力学检测，结果显示，HNO可以明显改善HF大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dt，与Chin等[8]的结果一致，再次证明HNO对心力衰竭心脏具有保护作用。LVEDP是重要的血流动力学指标之一，可在一定程度上反映心衰早期心脏的收缩功能、心脏负荷等。本实验表明，HNO可明显降低 HF大鼠LVEDP，减轻心脏负荷[9]，改善心脏功能。另外，HNO治疗组大鼠+dp/dt明显增加，说明HNO可以通过增加心脏收缩期收缩速度增强心肌收缩力，改善心脏收缩功能[6,7]。而-dp/dt主要反映心脏的舒张功能，在心衰后期dp/dt明显低于正常，经HNO治疗后-dp/dt较对照组升高，因此，HNO也可以通过改善心脏舒张功能[8]对衰竭心脏起保护作用。

NT-proBNP是反映HF程度的重要指标，与HF的严重程度呈正相关[10]。本实验中HNO供体AS治疗组大鼠外周血NT-proBNP水平较HF组明显降低，说明HNO可以减轻心室室壁张力，改善HF大鼠心功能，对HF大鼠有一定治疗作用。但各组间心体指数却无明显差异，可能是因为结扎LAD后局部心肌坏死、吸收与梗死周边区心肌细胞肥大、增生共存有关。

综上所述，HNO可以增强急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心脏功能，改善衰竭心脏血流动力学，降低外周血NT-proBNP水平，对心力衰竭大鼠心脏起保护作用，为心力衰竭的药物治疗提供新的方向。

本实验的不足之处是没有监测大鼠肝肾功能及其他系统的变化。今后实验中我们将进一步验证HNO在改善心功能的同时是否对其他系统产生不利影响，为HNO的安全性收集相关证据。

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The protective effect of Nitroxylon the heart of ratsw ith heart failure

XU Ji-yao，GUO Yan-qing，YANG Jin-jing，et al.The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

WANG Jing-ping，E-mail：525722439@qq.com

ObjectiveTo explore whether nitroxyl has a protective effect on the heart of rats with heart failure.M ethods50 male Wistar rats were selected and 42 rats out of them were selected to build heart failure model after acute myocardial infarction by a ligation of anterior descending branch，17 rats survived，which were randomly divided into heart failure group（HF group，n=8）and nitroxyl-treated group（HNO group，n=9），the remaining 8 rats were taken as a sham operation group（n=8），Nitroxyl donor Angeli′s saltwere intraperitoneal injection to HNO group from the day 3 after operation，the HF group and the sham group were given the same dose normal saline，4 weeks later，the level of NT-ProBNP in rats′peripheral blood had been tested by ELISA method，the ultrasonic cardiogram and the left-heart pressure transducer were used to test the rats′cardiac function，the rats were eventually killed to calculate the heart-body index.ResultsAt week 4 after operation，compared with heart failure group，the nitroxyl-treated group had a significant decline in NT-proBNP，LVEDP［（385.65±43.50）pg/ml vs（496.13±52.80）pg/ml，P＜0.01，（17.49±2.04）mm Hg vs（21.19±1.91）mm Hg，P＜0.05］，and a significant increase in LVEF，LVFS，+dp/dt，-dp/dt［（52.88±5.46）%vs（39.71±3.64）%，P＜0.01，（23.75±3.11）%vs（16.57±1.72）%，P＜0.01，（3029.13±634.12）mm Hg/s vs（2347.43±451.38）mm Hg/s，P＜0.05，（2896.50±642.66）mm Hg/s vs（2169.29±433.17）mm Hg/s，P＜0.05］，the difference in HW/BW、LVEDd，LVSP between the two groups were not significant［（2.97±0.17）g/kg vs（2.98±0.16）g/kg，（7.19±0.87）mm vs（7.66±0.84）mm，（131.38±9.47）mm Hg vs（130.57±11.46）mm Hg，P＞0.05］.ConclusionNitroxyl is able to enhance the cardiac function of the rats having heart failure，improve the hemodynamics，reduce the level of NTProBNP in peripheral blood，exert a protective effect on the heart of rats having heart failure.

Heart failure； Nitroxyl； Pressure transducer； Hemodynamics

山西省卫生计生委科研课题（项目编号：2015070）

030001 山西省太原市，山西医科大学第一临床医学院通讯作者：王敬萍，E-mail：525722439@qq.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2017．01．024

Q95-33；R541.6

A

1672-5301（2017）01-0086-04