联合补充维生素D、胶原肽和钙对成骨细胞发育的影响

朱小语，陈晓文，许 丹，律 颖，许雅君，2

(1 北京大学公共卫生学院，北京 100191；2食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室，北京 100191)

联合补充维生素D、胶原肽和钙对成骨细胞发育的影响

朱小语1，陈晓文1，许 丹1，律 颖1，许雅君1，2

(1北京大学公共卫生学院，北京 100191；2食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室，北京 100191)

目的：观察联合补充维生素D、胶原肽和钙对MC3T3-E1成骨细胞增殖及对骨保护素细胞内核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)、骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)基因表达的影响。方法：α-MEM培养基培养MC3T3-E1细胞。检测Ca2+(20 μg/mL)、维生素D(0、10-12、10-11mol/L)、胶原肽(0、50、100μg/mL)三者交互作用剂量对MC3T3-E1细胞增殖的作用及RANKL、OPG mRNA表达。结果：维生素D、胶原肽和钙交互剂量作用下细胞增殖水平无明显差异。维生素D联合钙能够明显降低RANKL mRNA表达水平，提高OPG mRNA表达水平，降低RANKL/OPG比值。而胶原肽联合钙对RANKL以及 OPG mRNA表达无明显影响。结论：维生素D联合钙可通过抑制小鼠成骨细胞RANKL mRNA表达、促进OPG mRNA表达，从而促进骨的形成，抑制骨的吸收。维生素D和钙联合补充胶原肽，对成骨细胞RANKL，OPG mRNA表达并无明显影响。

MC3T3-E1；维生素D；胶原肽；RANKL；OPG

骨质疏松症作为常见慢性非传染性疾病，已成为全球主要公共卫生问题[1]。骨的发育受骨形成和骨吸收双向影响，并在多种代谢通路调节下维持平衡和稳定。维生素D、胶原肽和钙作为维持机体健康的重要营养物质，在骨骼发育上起到至关重要的作用[2]。联合补充维生素D和钙，具有预防骨质疏松的作用[3-4]。同时，胶原肽在促进钙磷等矿物质吸收和调节骨骼发育中发挥重要作用[5-6]。体外试验表明，单独补充小分子肽类，能够通过调节骨保护素/核转录因子κB受体活化因子配体系统，间接抑制破骨细胞数量及功能[7]。联合补充小分子多肽和钙，同样促进成骨细胞OPG mRNA表达、抑制RANKL mRNA表达，抑制骨吸收[8]。

然而，目前并未有关于维生素D、胶原肽和钙三者联合作用的相关实验报道。为此，本研究采用体外培养成骨细胞为实验模型，探讨联合补充维生素D、胶原肽和钙三者对成骨细胞增殖以及RANKL、OPG基因表达的影响，为骨质疏松临床干预研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 受试物

维生素D3：总脱钙化固醇，购自Sigma公司，批号47763；胶原肽：Peptan水解胶原肽，平均分子量2 000D；钙：氯化钙，Sigma公司购得，批号C7902-500G。

1.2 仪器与试剂

Real time PCR仪(CFX9600，Bio-Rad，美国)、酶标仪(DNM-9602G，北京普朗技术有限公司)、MC3T3-E1细胞(中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)、Maxima SYBR Green/Rox qPCR Master Mix(Fermentas，K0222)、TRIzol(Invitrogen，15596018)、α-MEM(Hyclone，SH3026501B)、FBS(Sciencell，0510-500ML)、青霉素-链霉素溶液(Beyotime，C0222)、DMSO(Applichem，A3672.0100)、MTT(beyotime，C0009)。

1.3 细胞培养

小鼠MC3T3-E1细胞在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的α-MEM培养基中培养，置于37°C、5%CO2的体积分数的孵育箱中孵育。每2天更换1次培养基，待细胞基本融合后传代。

1.4 细胞增殖实验

MTT法检测细胞增殖分化能力，以7×103细胞/孔密度接种至96孔板中，每孔200μL，孵育16h后，吸弃培养液，各组设6个复孔，每孔加入受试物200μL，终质量浓度如表1。孵育箱培养24h，每孔加入MTT液20μL，继续孵育4h后轻轻吸弃上清液，每孔加入150μL DMSO，水平摇匀，酶联免疫检测仪490nm波长处测定各孔吸光度值，结果以OD490表示。

表1 各组受试物剂量

1.5 RANKL和OPG基因表达水平检测

细胞经72h干预后将其裂解，受试物终质量浓度同表1，Trizol法提取细胞总mRNA。用Maxima SYBR Green试剂盒将总mRNA反转录为cDNA，而后采用real-time PCR法检测RANKL、OPG基因表达水平，GAPDH为参照基因。各组各基因样本重复3次，25ul体系进行试验，基因相对表达量用2-ΔΔCt法进行计算。成骨细胞目的基因引物序列如表2所示。

表2 成骨细胞中目的基因引物序列

1.6 统计分析

2 结果与分析

2.1 细胞增殖实验

如图1所示，维生素D、胶原肽和钙三者交互作用干预下，随着受试物剂量的增加，成骨细胞增殖作用数值有上升趋势，但无统计学差异。

图1 维生素D、胶原肽和钙对细胞增殖率的影响

2.2 RANKL和OPG基因表达水平检测

表3为各剂量组RANKL/OPG mRNA相对表达量数值，图3分别列出维生素D基因表达水平[图2(1)、(3)、(4)]，以及胶原肽基因表达水平[图2(2)、(5)、(6)]。图2(3)可见，与对照组相比10-12mol/L和10-11mol/L剂量组维生素D，RANKL mRNA表达水平明显降低；图2(4)可见，与空白对照组相比，维生素D 10-12mol/L和10-11mol/L剂量组OPG mRNA表达水平明显增高，差别有统计学意义。且在维生素D的干预下，与对照组相比各剂量组的RANKL/OPG比值明显下降。

然而，胶原肽50μg/mL和100μg/mL剂量组在RANKL mRNA表达水平，OPG mRNA表达水平以及RANKL/OPG比值上与对照组均无明显差别，如图2(2)、(5)、(6)所示。

表3 维生素D、胶原肽和钙对RANKL/OPG mRNA表达量的影响

MC3T3-E1细胞培养基在添加钙的基础上，加入不同剂量浓度的维生素D与胶原肽，以观察二者对于骨发育相关基因表达的影响。维生素D与胶原肽在两因素两水平交互作用分析中交互作用有意义，而二者单独作用显示维生素D的单独效应差异有统计学意义，胶原肽的单独效应差异不显著。如图3(1)所示，随维生素D剂量的增加，RANKL/OPG比值呈降低趋势，而3(2)中随着胶原肽剂量的增加，RANKL/OPG比值并无明显统一的变化趋势。

3 讨论

骨代谢在骨形成和骨吸收过程中维持动态平衡，BMP/Smads、Wnt/β-catenin、RANKL/RANK/OPG、TGF-β、FGF、PDGF、Akt2等信号系统均在骨代谢过程中起到重要的信号调节作用[9-10]。其中，RANKL/RANK/OPG信号系统作为影响骨吸收的重要通路，参与到骨重建过程当中[11]。

图2 维生素D、胶原肽和钙对成骨细胞骨发育相关基因表达的影响

图3 维生素D、胶原肽和钙对RANKL/OPG mRNA相对表达量的交互作用影响

本研究以不同剂量浓度的胶原肽、维生素D联合钙干预MC3T3-E1细胞，测定RANKL、OPG mRNA表达水平，RT-PCR结果表明，维生素D和胶原肽具有交互作用，可以在联合钙的基础上有效降低RANKL/OPG比值。单独效应中，维生素D与钙联合，OPG mRNA表达明显增加，RANKL mRNA表达显著降低。而胶原肽与钙联合，对RANKL和OPG mRNA表达均无明显影响。维生素D作用结果同李长春等人关于1，25(OH)2D3诱导体外细胞成骨分化研究结果一致，表明维生素D与钙联合作用，可能与调节维生素D受体表达，间接影响RANKL、OPG基因的表达有关[12]。此外，Erin Gaffney-Stomberg[13]等人在对440名志愿者进行的随机双盲安慰剂对照试验中，发现联合补充维生素D和钙可通过调节钙敏感受体和甲状旁腺素水平，有效降低RANKL/OPG基因表达水平，将本细胞实验结果在人群实验中得到证实。然而，胶原肽与钙的联合作用结果同魏丽[8]等人的研究并不一致，胶原肽对RANKL、OPG基因表达的作用并不明显，可能与联合作用剂量有关，仍有待进一步研究。

4 结论

维生素D与钙联合作用，可通过影响RANKL/RANK/OPG系统平衡，抑制成骨细胞RANKL mRNA表达、促进OPG mRNA表达，抑制破骨细胞分化，抑制骨吸收。维生素D和钙联合补充胶原肽，对成骨细胞RANKL、OPG mRNA表达并无明显影响。◇

[1]Golob AL，Laya MB.Osteoporosis：screening，prevention，and management.[J].Med Clin North Am，2015(99)：587-606.

[2]Beto JA.The role of calcium in human aging.[J].Clinical Nutritional Research，2015(4)：1-8.

[3]Boonen S，Lips P，Bouillon R，et al.Need for additional calcium to reduce the risk of hip fracture with vitamin D supplementation：evidence from a comparative meta-analysis of randomized controlled trials[J].Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，2007(92)：1415-1423.

[4]Lips P，Gielen E，van Schoor NM.Vitamin D supplements with or without calcium to prevent fractures.BoneKEy Reports，2014(512)：1-6.

[5]Guillerminet F，Beaupied H，et al.Hydrolyzed collagen improves bone metabolism and biomechanical parameters in ovariectomized mice：An in vitro and in vivo study.[J].Bone，2010(46)：827-834.

[6]Xu Y，Han X，Li Y.Effect of marine collagen peptides on long bone development in growing rats.[J].J Sci Food Agric，2010(90)：1485-91.

[7]吴昆鹏，杨巧珠，等.小分子肽对成骨前体细胞MC3T3-E1骨保护素和核转录因子κB受体活化因子配体表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(24)：4375-4378.

[8]魏丽，刘盟，等.蓇密钙片与马鹿角多肽对成骨细胞增殖分化的研究[J].中国骨质疏松杂志，2010，6(8)：563-570.

[9]熊燕琴，周筠，等.骨代谢信号通路的研究进展[J].中国骨质疏松杂志，2014，20(2)：200-204.

[10]曾羿，沈彬.分子信号通路在骨质疏松防治中的研究进展[J].中国骨质疏松杂志，2014，20(3)：305-309.

[11]Boyce BF，Xing L.Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and remodeling[J].Arch Biochem Biophys，2008(473)：139-46.

[12]李长春，孙莲莲，等.1，25(OH)2D3在牙乳头干细胞成骨分化中的作用[J].天津医药，2014，42(5)：421-423.

[13]Erin Gaffney-Stomberg，Laura J.Lutz，et al.Calcium and vitamin D supplementation maintains parathyroid hormone and improves bone density during initial military training：A randomized，double-blind，placebo controlled trial[J].Bone，2014(68)：45-56.

(责任编辑 李婷婷)

Effects of Combined Supplementation of Vitamin D，Collagen Peptides and Calcium on Development of Osteoblasts

ZHU Xiao-yu1，CHEN Xiao-wen1，XU Dan1，LV Ying1，XU Ya-jun1，2
(1Peking University Health Science Center，Beijing 100191，China；2Beijing Key Laboratory of Toxicological Research and Risk Assessment for Food Safety, Beijing 100191, China)

MC3T3-E1；vitamin D；collagen peptide；RANKL；OPG

北京市科技创新基地培育与发展专项(项目编号：Z151100001615035)。

许雅君(1976— )，女，博士，教授，研究方向：营养与疾病。

并列第一作者：朱小语(1990— )，女，硕士研究生，研究方向：营养与疾病；陈晓文(1989— )，男，硕士研究生，研究方向：营养与疾病。