β淀粉样蛋白25～35对PC12细胞凋亡相关蛋白表达的影响

王瑞婷 王爱霞 狄婷婷 张 美 申兴斌

(承德医学院，河北 承德 067000)

β淀粉样蛋白25～35对PC12细胞凋亡相关蛋白表达的影响

王瑞婷 王爱霞 狄婷婷 张 美 申兴斌1

(承德医学院，河北 承德 067000)

目的探讨β淀粉样蛋白(Aβ)25～35对PC12细胞凋亡相关蛋白表达的影响。方法采用不同浓度的Aβ25～35与PC12细胞共孵育48 h后,用MTT法检测细胞生长活性，Hoechst33258核染色检测细胞凋亡，通过免疫细胞化学检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达。结果MTT检测显示Aβ25～35抑制PC12细胞生长活性呈浓度依赖性，抑制作用随Aβ25～35浓度的增大而加强；Hoechst33258染色显示Aβ25～35与PC12细胞凋亡呈浓度依赖性关系；免疫细胞化学检测结果显示Bcl-2蛋白表达量随Aβ25～35浓度的增大呈下降趋势，Bax、Caspase-3蛋白表达量随Aβ25～35浓度的增大呈上升趋势。结论Aβ25～35可剂量依赖性诱导PC12细胞凋亡，使抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，促凋亡蛋白Bax,Caspase-3表达上调。

β淀粉样蛋白；PC12；凋亡；Bcl-2；Bax；Caspase-3

阿尔茨海默病(AD)患者脑内的老年斑由β淀粉样蛋白(Aβ)异常沉积形成。Aβ作为AD发病的始动因子已得到广泛的认可〔1〕，研究发现Aβ诱导神经元凋亡,其机制成为AD的发病机制研究热点之一〔2,3〕。Aβ由39～43个氨基酸组成，引起神经毒性主要活性部位在第25～35氨基酸之间(Aβ25～35)〔4〕。Aβ对在体及体外神经元的毒性作用依赖于其聚集状态与浓度，为进一步分析其作用机制，本课题分析离体实验中Aβ25～35对PC12细胞凋亡相关蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1试剂 Aβ25～35(Lot：990307)由北京博奥森生物技术有限公司提供；MTT(Lot:08E21C01),一抗兔抗大鼠Bcl-2多抗(Lot:195841)、兔抗大鼠Bax多抗(Lot:11201)、兔抗大鼠Caspase-3多抗(Lot:Y-C4-08D22C),即用型SABC试剂盒(Lot：08A22C)，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(Lot：08A04A22)，由武汉博士德生物工程有限公司提供。PC12细胞(CX0247)，胎牛血清(FBS)(Lot：10J30C01)由武汉博士德生物工程有限公司提供；DMEM(Lot:681841)由Gibco提供；胰酶(Lot:CAS#9035-81-8)由上海蓝基科技发展有限公司提供。

1.2凝聚态Aβ25～35制备 用超纯水将冻干的Aβ25～35充分溶解配置100 μmol/L母液并过滤分装，-20℃保存，使用前于37℃恒温箱孵育5～7 d使其形成凝胶态，取适量加入培养细胞中使达到所需终浓度。

1.3细胞培养 PC12细胞接种于培养皿中，培养在含10% FBS的高糖DMEM培养液中，内含青霉素、链霉素各100 U/ml,隔天换液，4 d传一代。采用对数生长期的细胞进行实验。

1.4MTT法检测细胞生长活性 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度5×107/L，每孔加入100 μl，边缘孔用无菌PBS填充,5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底;加入浓度梯度的Aβ25～35，使其终浓度为0.1、1、2、5、10、20 μmol/L，同时设立对照孔和调零孔,每组设4个复孔。培养48 h后，每孔加入10 μl MTT染色液，继续培养4 h；每孔加入10 μl MTT染色液，继续培养4 h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2～3遍后，再加入含MTT的培养液。每孔加入100 μl Formanzan溶解液，置摇床上低速振荡10～30 min，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪570 nm测定吸光度(OD)值，计算细胞存活率。细胞存活率=(加药细胞OD-调零孔OD值)/(对照细胞OD-调零孔OD值)×100%。

1.5细胞爬片制备 取在70%乙醇中浸泡的洁净盖玻片，用无菌的PBS溶液洗涤3遍，再用细胞培养液洗涤1遍，将盖玻片置于24孔板，种入对数生长期细胞培养过夜，使爬片约为80%满。由MTT检测结果选择3个浓度梯度的Aβ25～35,刺激细胞48 h,并设置对照组。48 h后，吸尽培养液，加入0.5 ml固定液，固定10 min,去固定液，自然晾干5 min,用PBS洗两次，每次3 min，吸尽液体，4℃保存备用。

1.6Hoechst33258核染色 每张爬片加入0.5 ml Hoechst33258染色液，染色5 min；去染色液，用PBS洗两遍，每次3 min，吸尽液体；滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的爬片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡；荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核，激发波长350 nm左右，发射波长460 nm左右。

1.7免疫细胞化学染色 细胞爬片用0.25%TritonX-100室温处理15 min,PBS洗3次，用3%H2O2室温处理15 min以灭活内源性酶,PBS洗3次，5%BSA37℃封闭20 min，吸尽封闭液，不漂洗；加一抗Bcl-2(1∶100)、Bax(1∶100)、Caspase-3(1∶100)，4℃过夜。第2天37℃孵育25 min，PBS洗3次，山羊抗兔IgG 37℃孵育20 min,PBS洗3次，SABC37℃孵育20 min,PBS洗3次，DAB显色2～10 min，光镜下观察阳性显色为棕黄色，用蒸馏水冲洗10 min终止反应。苏木素轻度复染5～10 min，70%、80%、95%、100%乙醇各5 min,二甲苯10 min,甘油封片后光学显微镜进行观察。每组选取3张爬片，光镜下每张爬片随机选取3个不重复视野在400倍视野下采用Image-Pro Plus6.0图像分析系统，测量每组爬片的平均光密度值，用于定量分析免疫细胞化学阳性反应程度。

1.8统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1Aβ25～35对PC12细胞活力的影响 Aβ25～35与PC12细胞活力呈现浓度依赖性的关系，低浓度Aβ25～35对PC12细胞活力影响小，随着Aβ25～35浓度的增大，PC12细胞活力明显受到抑制。1 μmol/L以上浓度组Aβ25～35刺激48 h后即可出现细胞活力明显下降(P<0.05),Aβ25～35浓度达到10 μmol/L时，细胞存活率达到48.7%，此浓度已显示出较强的细胞毒性作用。后续实验采用0、1、5、10 μmol/L的Aβ25～35。见表1。

表1 不同浓度Aβ25～35对PC12细胞细胞活力的影响

与0 μmol/L Aβ25～35比较：1)P<0.05；与0.1 μmol/L Aβ25～35比较：2)P<0.05

图1 不同剂量Aβ25～35对PC12细胞凋亡的影响(Hoechst33258,×400)

2.2Hoechst33258核染色观察Aβ25～35对PC12细胞凋亡的影响 见图1。Hoechst33258染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈蓝色，凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色发白。实验采用0、1、5、10 μmol/L的Aβ25～35作用PC12细胞48 h，显示对照组细胞的细胞核呈蓝色，仅有个别细胞的细胞核颜色有些发白；而Aβ25～35组细胞,呈现细胞核浓染或颗粒状荧光团块增多，随Aβ25～35浓度增大细胞核呈碎块状致密浓染，颜色发白的趋势增强，即Aβ25～35与PC12细胞凋亡呈浓度依赖性关系。

2.3不同浓度Aβ25～35对PC12细胞Bcl-2表达水平的影响 镜下可见PC12细胞Bcl-2阳性反应为胞质棕黄色颗粒，有时可见核膜着棕黄色。Bcl-2免疫细胞化学显示对照组和不同浓度Aβ25～35组均有Bcl-2阳性表达，与对照组相比，不同浓度Aβ25～35组Bcl-2阳性表达均明显减少(P<0.05);随着浓度增加Bcl-2阳性表达逐渐减少，不同浓度组间差异显著(P<0.05)。Bcl-2表达量与Aβ25～35浓度相关，Aβ25～35浓度越大，Bcl-2阳性表达越少。见图2，表2。

2.4不同浓度Aβ25～35对PC12细胞Bax表达的影响 PC12细胞Bax阳性反应为胞质棕黄色颗粒,有时可见核膜着棕黄色。与对照组相比，各Aβ25～35组Bax阳性表达均明显增加(P<0.05)，随Aβ25～35浓度增加Bax阳性表达逐渐增加，10 μmol/L组胞核黄染，着色深，不同Aβ25～35组间比较有统计学差异(P<0.05)。Bax表达量与Aβ25～35浓度相关，Aβ25～35浓度越大，Bax阳性表达越多。见图3，表2。

图2 不同剂量Aβ25～35对PC12细胞Bcl-2 表达的影响(DAB，×400)

表2 不同浓度Aβ25～35对PC12细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3表达水平的影响

与对照组比较：1)P<0.05；与1 μmol/L Aβ25～35比较：2)P<0.05；与5 μmol/L Aβ25～35比较：3)P<0.05

2.5不同浓度Aβ25～35对PC12细胞Caspase-3表达水平的影响 PC12细胞Caspase-3阳性反应为胞质着棕黄色颗粒。与对照组相比，不同浓度Aβ25～35组Caspase-3阳性表达均明显增加(P<0.05);随Aβ25～35浓度增加，Caspase-3阳性表达逐渐增强，10 μmol/L组胞核黄染，着色深，不同浓度组间比较有统计学差异(P<0.05)。Caspase-3表达量与Aβ25～35浓度相关，Aβ25～35浓度越大，Caspase-3阳性表达越多。Caspase-3的表达量与Aβ25～35浓度呈依赖性相关。见图4，表2。

图4 不同剂量Aβ25～35对PC12细胞Caspase-3表达的影响(DAB，×400)

3 讨 论

研究表明凋亡是AD病程中神经元大量丢失的主要原因〔5，6〕,但其具体机制尚不明确。细胞凋亡是受促凋亡基因和抑制凋亡基因协同控制的细胞主动死亡过程。目前认为Bcl-2,Bax,Caspase-3基因与凋亡调控关系更为密切。Bcl-2基因促进细胞增殖，过度表达可特异性抑制细胞凋亡。有研究证实Bcl-2过表达可减轻中枢神经系统损伤导致的神经元凋亡〔7～9〕，可能减少中枢神经系统损伤后神经元病理后遗症〔10〕。本实验结果显示随着Aβ浓度的增大，Bcl-2 表达逐渐减弱，对神经元保护作用减弱，神经元凋亡明显。Bcl-2抗凋亡的机制目前认为主要有：拮抗促凋亡基因Bax；抑制促凋亡的蛋白质细胞色素C自线粒体释放到胞质；阻止胞质中的细胞色素C激活Caspase；有抗氧化及维持细胞内钙稳态等作用。Bax基因属于Bcl-2 基因家族，编码的Bax蛋白可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2 产生阻抑作用。Bax基因过度表达加速细胞凋亡，并对抗Bcl-2基因抑制细胞凋亡的作用〔11，12〕。研究发现Bax/Bcl-2蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素〔13〕，促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2在中枢神经系统均有表达，其比值的大小决定神经元受到凋亡信号刺激后趋向于存活与凋亡的抉择，形成细胞凋亡调控的按钮〔14〕。有研究发现上调Bax蛋白水平的表达和Bax/Bcl-2比值增大可诱导神经元凋亡〔15〕，脑室内低温能够通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平降低急性脑缺血后神经元凋亡〔16〕。刘真苓等〔17〕研究发现腺苷处理后可减少犬脊髓缺血再灌注后神经元凋亡，其保护作用可能与Bax表达减少和Bcl-2表达增多有关。近期有研究学者发现栀子苷通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平，下调促凋亡蛋白Bax表达水平及转录因子p53水平可延缓AD的发展〔18〕。本实验发现随着Aβ浓度增大，抗凋亡的Bcl-2表达逐渐降低，促凋亡的Bax表达逐渐增强，Bax/bcl-2比值增加，神经元凋亡明显。促凋亡的Bax与抗凋亡的Bcl-2两者之间的比值同时决定促凋亡基因Caspase-3的激活程度〔19〕。Caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用，Caspase-3激活与cyt-c自线粒体释放、线粒体损伤、神经元凋亡密切相关〔20〕。Caspase-3是激活细胞凋亡的关键因子，进一步激活其它凋亡蛋白表达，致细胞不可逆性凋亡。由死亡受体、线粒体/细胞色素、内质网介导的细胞凋亡的三类信号通路，最终均会引起Caspase瀑布效应〔21〕。Aβ可以引起活性氧(ROS)增多〔22〕，通过ROS引起cyt-c释放，激活Caspase引起Caspase依赖性凋亡。本实验发现高浓度Aβ使Bax/Bcl-2比值增大，Caspase-3表达增加。本研究组在整体实验研究中也发现Aβ对凋亡相关蛋白表达的影响〔23〕。

Aβ25～35能够剂量依赖性地诱导PC12细胞凋亡，其机制可能为通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，上调促凋亡蛋白Bax,Caspase-3表达实现。因此，进一步通过筛选具有上调Bcl-2蛋白表达,抑制Bax,Caspase-3蛋白表达活性，抑制神经元凋亡，延缓AD病程发展的药物，将成为AD的研究热点之一。

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〔2016-05-19修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

河北省教育厅重点资助课题(No.ZD20131051);河北省高校省级重点学科项目资助(〔2013〕4号);河北省中医药抗痴呆重点研究室资助(2014年)

王瑞婷(1969-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事中药抗痴呆作用及机制研究。

R749

A

1005-9202(2017)17-4179-05；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.005

1 承德医学院附属医院