萎胃康对萎缩性胃炎大鼠TFF3和Bcl-2表达的影响

林海燕 于佳宁 翟佳丽 赵 岩

(滨州医学院,山东 烟台 264003)

萎胃康对萎缩性胃炎大鼠TFF3和Bcl-2表达的影响

林海燕 于佳宁1翟佳丽 赵 岩

(滨州医学院,山东 烟台 264003)

目的以肠三叶因子(TFF3)和B细胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)两种蛋白为切入点，探讨萎胃康治疗慢性萎缩性胃炎(CAG)的可能机制。方法SD大鼠84只随机分为造模组70只，正常对照组14只。采用复合造模法制备CAG大鼠模型，经6 w造模成功后，将造模组剩余的60只大鼠随机分为模型对照组及萎胃康高、中、低剂量组和阳性药物组(12只/组)。各组给予相应的药物，每天灌胃1次，连续治疗30 d后，分别用Real-time PCR法和Western印迹法检测各组大鼠胃黏膜TFF3和Bcl-2两种蛋白的表达。结果与正常组比较，模型组大鼠胃黏膜TFF3 mRNA表达和Bcl-2蛋白表达均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，各治疗组大鼠胃黏膜TFF3 mRNA表达和Bcl-2蛋白表达均显著降低(P<0.05)；其中以萎胃康高剂量组降低最明显，较萎胃康中、低剂量组有显著差异(P<0.05)。结论抑制胃黏膜TFF3和Bcl-2表达是萎胃康颗粒治疗CAG的机制之一。

萎胃康；萎缩性胃炎

慢性萎缩性胃炎(CAG)为消化系统的一种难治疾病，若伴有肠上皮化生或不典型增生，被称为癌前病变。萎胃康颗粒系本课题组经多年临床观察研制出的一种治疗CAG的有效方剂。经临床研究及前期动物实验研究证实对CAG有确切疗效。本文以B细胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)和肠三叶因子(TFF3)两种蛋白为切入点，研究萎胃康对CAG大鼠治疗的机制。

1 材料与方法

1.1材料 SD大鼠(体重180～200 g，温度25℃，湿度50%)。萎胃康颗粒，组方为西洋参、白术、白芍、三七粉、延胡索、熊胆、甘草，由滨州医学院附属医院制剂室提供；使用当日，配制成300、150和75 mg生药/ml 3种不同浓度的药液。维霉素糖衣片(湖北绿金子药业有限责任公司，批号：100903)使用当日去糖衣，放入研钵中研为细末，用蒸馏水制成30 mg/ml悬浊液。水杨酸钠(上海国药集团化学试剂有限公司，批号：T20100125)配成浓度为2%的水杨酸钠溶液。TRIzol试剂盒(TaKaRa)、反转录试剂盒(Gene Copoeia.inc)、RNA-free and DNA-free(Bioteke CorporationTaq)、荧光定量试剂盒(Gene Copoeia.inc)。PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1造模与分组 从84只SD大鼠中随机取出70只为造模组，参照文献〔1〕采用复合造模法制作大鼠CAG模型，即2%水杨酸钠溶液，1次/d，每次灌胃2 ml，连续灌胃6 w，且灌胃前、后1 h禁食、禁水；术前3 w自由进食、进水；术后3 w单日禁食、不禁水，双日足量喂食，自由进水，且进食后立即于温水中游泳1次，时间为10 min。剩下的14只为正常对照组，正常饲养。6 w后，从造模组随机取出10只、正常对照组随机取出2只做常规病理。经病理确认造模成功后，将造模组余下60只大鼠随机分为模型对照组、萎胃康高、中、低剂量组和阳性药物组。除正常对照组和模型对照组灌胃生理盐水1 ml/100 g体重外，其余各治疗组分别给予300、150、75 mg生药/ml的萎胃康水溶液和30 mg/ml的维酶素混悬液，均按1 ml/100 g体重，1次/d。持续治疗30 d。

1.2.2取材与标本制备 末次给药24 h后，以2%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射。麻醉后，剖腹，摘取全胃，沿胃大弯侧剪开，冷生理盐水漂洗内容物。取胃小弯侧胃窦部黏膜装入冻存管中，封口膜封口后，放入液氮中保存。

1.2.3Real-time PCR法检测TTF3 mRNA表达量 提取胃总RNA，反转录后进行PCR扩增。反应条件：预变性94℃，5 min；变性，95℃，30 s；退火，58℃，30s；延伸，72℃，30 s；共进行40个循环的扩增，72℃后延伸5 min。实验中同步进行内参基因β-actin的定量检测，以目的基因与内参基因相对浓度比作为目的基因的相对表达量。扩增反应在荧光定量PCR 仪上进行，各样品的荧光信号值由荧光定量PCR 仪的支持软件ABI Prism7000SDS software 实时产生并自动计算定量数值。

1.2.4Western印迹法检测Bcl-2蛋白表达量 从胃组织中提取蛋白，测定蛋白的浓度。取40 μg总蛋白与上样液混合，上样前煮沸5 min变性，将蛋白加入点样孔，保证每孔蛋白量相同。电泳初始电压80 V，溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后电压提至100 V。湿转法，转膜条件：300 mA 恒流，90 min。转膜结束后，PVDF 膜取出并用marker笔标记膜的方向。将膜完全浸没于甲醇2 min，蒸馏水5 min，转膜缓冲液15 min。5%BSA-TBST 稀释一抗，1∶1 000，4℃水平摇床孵育过夜。次日，TBST 洗3 次，每次10 min。5% BSATBST稀释二抗，1∶500，室温孵育45 min。TBST洗膜3 次，每次10 min。加入显影液，暗室显色，扫描胶片，用软件分析目的条带灰度，经内参β-actin 校正后进行统计学分析。

1.3统计学处理 使用SPSS19.0软件计量数据组间差异采用One-Way ANOVA分析。

2 结 果

2.1各组大鼠胃黏膜TFF3 mRNA表达量的比较 模型对照组TFF3 mRNA表达(1.211±0.037)较正常对照组(1.077±0.009)显著升高(P<0.05)；药物治疗后，各治疗组较模型对照组显著降低，以萎胃康高剂量组(1.096±0.052)降低最明显，萎胃康中、低剂量组(1.128±0.013,1.156±0.026)较萎胃康高剂量组有显著差异(P<0.05)，阳性药物组为1.117±0.023。

2.2各组大鼠胃黏膜Bcl-2蛋白表达量比较 模型对照组Bcl-2蛋白表达〔(101.02±4.61)×10-3〕最高，其次是萎胃康低剂量组〔(73.00±3.96)×10-3〕、萎胃康中剂量组〔(64.45±2.87)×10-3〕、阳性药物组〔(56.67±4.08)×10-3〕、萎胃康高剂量组〔(52.15±2.09)×10-3〕(图1)。正常对照组〔(54.50±4.60)×10-3〕、各治疗组较模型对照组有显著性差异(P<0.05)；与萎胃康高剂量组比较，萎胃康中、低剂量组具有显著性差异(P<0.05)。

1：正常对照组；2：模型对照组；3：萎胃康低剂量组；4：萎胃康中剂量组；5：萎胃康高剂量组；6：阳性药物组图1 各组大鼠胃黏膜Bcl-2蛋白表达量

3 讨 论

CAG在中医学中属于“胃脘痛”、“嘈杂”、“胃痞”等范畴。大多由于饮食不节，戕伤中州；或外邪内侵，损及脾胃；或忧思郁怒，肝失疏泄，横逆犯胃；或禀赋不足，脾胃虚弱等。病变初期以湿热阻滞、气郁不畅为主，久则脾胃气阴受损，或脾气虚弱或胃阴损伤，进一步发展可因气不行血或阴不荣络致胃络血瘀。据此，笔者确立了补脾健胃、益气养阴、理气活血解毒之组方原则，创立了临床经验方萎胃康。方中西洋参为君药，白术、白芍为臣药，延胡索、三七、熊胆为佐药，甘草为佐使药。诸药相合，具有阴阳平衡、寒热互制、攻补兼施、升降协调的特点。

方中西洋参中多种组分均具有抗肿瘤活性，Murphy等〔2〕研究表明人参皂苷Rg3具有抗癌活性；白术具体胃黏膜保护和抗肿瘤作用，沈国庆等〔3〕将从白术挥发油中分离得到的3个化合物，按不同剂量进行抗肿瘤实验，结果发现均有抑瘤作用；延胡索中的总生物碱是延胡索抗肿瘤的主要活性成分，它可在体外对肿瘤细胞的增殖产生较强的抑制作用，推测机制与诱导细胞凋亡、改变细胞周期时相分布、改变HepG2细胞mRNA表达谱有关〔4〕；以三七总甙为主的中药提取物能使原癌基因C-myc的表达减弱，同时增强抑癌基因P16的表达，可能是三七总甙为主的中药提取物治疗胃癌前病变有效的机制之一〔5〕；熊胆能有效清除亚硝胺前体物——亚硝酸钠，并阻断二甲基亚硝胺在体外的合成，表明熊胆能预防某些癌症。

TFF是一组具有特定三叶结构域的小分子多肽，在哺乳动物中包括3 个因子：乳腺癌相关肽TFF1、解痉多肽TFF2和肠三叶因子TFF3。其中，TFF3 参与受损胃黏膜修复，可保护胃肠黏膜，其表达与胃黏膜的损伤程度呈正相关〔6〕。一旦胃黏膜的修复得以完成，细胞停止移走。国外研究成果表明，在胃黏膜由肠化到不典型增生到胃癌的发展过程中，其表达不断增强〔7〕。国内，黄亚平等〔8〕亦有同样的报道。

根据TFF3 对胃黏膜的保护作用机制，推测中药萎胃康在治疗CAG 的过程中，TFF3 是过度表达的。随着疾病好转，TFF3 表达也随之下降。TFF3在此过程中起到了参与损伤黏膜再生和修复的作用。

正常胃黏膜凋亡细胞较少，胃黏膜上皮组织依靠维持细胞凋亡和增殖的平衡来保持正常状态。在胃黏膜的炎症病理变化中凋亡细胞明显增多，这种平衡被打破进而导致疾病的发生。1984 年，由Tsujimoro等最先分离出来Bcl-2，其过度表达会抑制细胞的凋亡，使细胞高速增殖，为向恶性细胞转化提供条件。肿瘤的发生是细胞增殖和凋亡异常的疾病。因此，有学者推测Bcl-2过度表达是胃癌演化过程中的早期事件〔9〕。

根据Bcl-2抑制细胞凋亡的作用，推测胃康在治疗CAG 的过程中，Bcl-2是过度表达的。随着疾病好转，Bcl-2表达也随之下降，并具有预防萎缩性胃炎癌变的作用。综上所述，抑制胃黏膜TFF3和Bcl-2的表达是萎胃康颗粒治疗CAG的机制之一。

1张淑芹，赵林山，郑继奎.慢性萎缩性胃炎动物模型的复制〔J〕.哈尔滨师范大学自然科学学报，2001；17(6)：81-3.

2Murphy LL.American Ginseng in the prevention and treatment of human breast cancer〔J〕.ANSI Std，2001；39(18)：298-102.

3沈国庆，何法霖，李凤新，等.白术挥发油化学成分及抗肿瘤实验研究〔J〕.北京中医药大学学报，2009；32(6)：413-5.

4张国铎.活性指导下中药独活与延胡索抗肿瘤有效成分的分离及其抑瘤作用研究〔D〕.南京：南京中医药大学，2009.

5李金霞.三七的药效与作用机制〔J〕.中外健康文摘，2008；5(4)：167.

6Ogata H，Podolsky DK.Trefoil peptide expression and secretion is regulated by neuropeptides and acetylcholine〔J〕.Am J Physio，1997；273(2 Pt1)：348.

7Leung WK，Yu J，Chart FK，etal.Expression of trefoil peptides(TFF1，TFF2，and TFF3) in gastric carcinomas，intestinal metaplasia，and non-neoplastic gastric tissue〔J〕.J Pathol，2002；197(5)：582.

8黄亚平，雷 琳，朱庆茹.胃癌及癌前病变组织三叶因3表达的相关性研究〔J〕.内科，2009；4(6)：854.

9Lkeda M，Shomori K.Frequent occurrence of spoptosit in an early event in the oncogenesis of human gastric carcinoma〔J〕.Virchows Arch，1998；432(1)：43.

〔2016-12-10修回〕

(编辑 曲 莉)

EffectofWeiweikangonTTF3andBcl-2expressionsinchronicatrophicgastritisinrats

LINHai-Yan，YUJia-Ning，ZHAIJia-Li，etal.

BinzhouMedicalUniversity，Yantai264003，Shandong，China

ObjectiveTo observe the effect of Weiweikang on the expressions of intestinal trefoil factor (TTF3) and B cell lymphoma 2 (Bcl-2) in chronic atrophic gastritis (CAG) in rats.Methods84 SD rats were randomly divided into model (n=70) and blank groups(n=14). CAG models were induced by composite molding method. After model induction, 60 remaining rats in model group were equally and randomly divided into model, Weiweikang high, middle and low dose and positive drug groups. Rats of each group were given the corresponding drug once daily. After treatment for 30 days, the expression of TTF3 mRNA was detected by Real-time PCR and the expression of Bcl-2 was detected by Western blot.ResultsCompared with those of normal group, the expressions of TTF3 and Bcl-2 in model group were significantly increased(P<0.05). Compared with those of model group, the expressions of TTF3 and Bcl-2 in each treatment group were significantly reduced(P<0.05). The expressions of TTF3 and Bcl-2 in Weiweikang high dose group were reduced most obviously compared with those of Weiweikang middle and low dose groups(P<0.05).ConclusionsThe mechanism of Weiweikang treating CAG might be related to inhibiting the expressions of TTF3 and Bcl-2.

Weiweikang;Chronic atrophic gastritis

国家自然科学基金项目(81273724)；山东省自然科学基金项目(ZR2014HL094)；山东省中医药科技发展计划项目(2013-249)

赵 岩(1964-)，女，教授，硕士，硕士生导师，主要从事中药复方治疗消化系统疑难杂症的基础研究。

林海燕(1978-)，女，副教授，博士，硕士生导师，主要从事中药复方药理研究。

R285

A

1005-9202(2017)17-4183-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.006

1 滨州医学院烟台附属医院