浅谈分子生物学在土壤微生物多样性研究中的应用

吴丽莉

摘要：传统的土壤微生物分离培养、鉴定技术难以深入了解微生物的生态学特性和多样性，而分子生物学方法可以获取更加丰富的土壤微生物群落多样性信息，包括傳统方法无法培养的土壤微生物。本文就目前土壤微生物的多样性研究中使用的分子生物学技术进行探讨研究，并对各个分子生物学实验技术的特点做了比较分析。

关键词：土壤微生物；生物多样性；分子生物学；DNA

一、土壤微生物多样性的定义

土壤微生物的多样性体现在生物体在遗传、种类和生态系统层次上的差异和变化，也反映了土壤生态机制对微生物群落的影响。土壤微生物多样性还可以理解为丰富的微生物生命。一般由土壤生物区的变化和生物化学过程间的关系来体现。

二、土壤微生物多样性研究中运用的分子生物学技术

（一）土壤微生物DNA复性动力学分析

实验表明，可以通过测定微生物群落DNA的复性率和解链行为来确定土壤微生物群落的大体成分和整体遗传多样性。微生物多样性的复杂程度随着DNA的同源性变化，DNA同源性越差，多样性越复杂，DNA的复性率就越低。在受不同程度重金属污染的土壤中微生物多样性的变化中这种方法被Sandaa等所采用。没有受到污染的对照土壤通过该技术分析显示含有32 000个细菌基因组，而这个数字在受重金属污染程度较轻的土壤是1 2800，在受严重重金属污染的土壤是4000个，相比未受污染的土壤中的细菌基因组分别减少了60%和90%。由数据可知，土壤受到污染越严重，土壤微生物多样性越低。但这个技术有明显的缺点，即分辨率不高，仅仅用这个技术来分析只能知道土壤微生物群落的大体情况，并不能精确表示微生物多样性的变化情况。因此在实际研究中，还需要结合核酸杂交等更好的技术才能得到更精确的结果。

（二）核酸分子杂交技术

20世纪70年代出现了分子生物学技术——核酸分子杂交技术。这种技术的原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则，将待测微生物的DNA或RNA与特异性探针进行杂交形成新的分子。核酸分子杂交技术由于其特异性灵敏性高的优点，在近年的微生物多样性研究中被广泛应用。其中最为常用的的手段是近年来发展起来的荧光原位杂交技术。它可以鉴定细胞形态和微生物种群结构，进行样品的原位杂交，也可用于测定细胞活性和计数。该技术根据已知微生物的不同类别种群特殊的DNS序列用荧光标记的特殊寡聚核苷酸片段作为探针，与待测微生物的DN分子杂交，以测定该微生物群落多样性的丰度。研究结果也显示，土壤微生物的多样性随土壤受污染程度的升高而下降，但是荧光原位杂交技术（FISH）对于土壤样品的灵敏度较低。

（三）基于PCR的分子生物学研究技术

PCR技术的出现和运用使土壤微生物生态学研究获得飞跃发展。由于土壤微生物群落的16S rRNA、18S rDNA 或ITS 区域目标基因含有高度保守序列、多拷贝序列和高度可变序列，因而其基因结构相对稳定，利于设计特异性引物，现已成为细菌分类学研究中最常用最有效的分子钟。此外，真菌ITS的分析也越来越受到重视，因为其序列中包含保守和可变信息。可以借助用特异性或通用引物在直接提取和纯化土壤微生物样品的总DNA后扩增目标片段，然后分期目标片段。基于PCR的分子生物学技术有以下几种。

1. 变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE）。该技术的原理是对DNS双链分子使用化学变性剂或温度对其进行处理，以分离序列不同但长度相同的DNA片段。可以根据条带的位置和电泳条带的数量大致确定土壤中的微生物种类，对土壤中的微生物的多样性进行粗略分析。此方法有很高的灵敏度，通过成像系统分析染色后的凝胶，切下目标带进行扩增或测序可以获取更完整的信息。除此之外DGGE/TGGE技术因为能同时测定多个土壤样品的微生物群落构成和变化情况，具有可重复性、快速等特点，所以被广泛应用在土壤微生物的多样性研究等方面。其缺点是，目前还不能检测到所有的微生物多样性，特变是难以检测到劣势微生物种群。

2.单链构象多态性（SSCP）。SSCP方法的原理是，单链DNA的构象会随着碱基的变化而变化，而具有不同空间构象的单链DNA分子在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的带型也不同，以此精确地区分二级结构不同但大小一样的PCR产物。在研究高温堆肥微生物群落、根系微生物、受污染的土壤微生物生态多样性方面SSCP方法已经被成功应用。比如通过该方法分析根系微生物，已准确地检测到微生物群落的动态变化，SSCP方法比传统培养更加省时省力，避免了误差大的干扰，在对微生物群落结构和演替的分析中非常适用。

3.限制性片段长度多态性（RFLP）/扩增核糖体DNA限制性分析（ARDRA）。限制性片段长度多态性（RFLP）另一个名称是扩增核糖体DNA限制性分析（ARDRA），该技术通过通用引物扩增DNA目标片段（如：16S rDNA），然后将其克隆转移至大肠杆菌中，将阳性克隆筛选出来，建立16S rDNA克隆文库。然后用带有目标基因的克隆细胞作为PCR模板，利用限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切，进过电泳之后，可对酶切片段进行限制性多态性分析。该技术的特点是能对微生物种群的目标DNA构成进行直接研究，而且限制性内切酶识别序列专一性使得RFLP技术就有较高的可靠性。此外，该技术涉及较多的遗传信息，因此具有较强的区分种群差异的能力。

4.末端限制片段长度多态性（T-RFLP）。T-RFLP是在RFLP方法的基础上加以改良，在PCR扩增16S rRNA基因过程中，使用荧光标记一个引物用，而且仅仅分析被标记的末端限制片段，以此简化多态性图谱，使得每个可见的条带都代表一个“核型”或一个分类单元，最后得到一个微生物群落的特征指纹图谱。可用于比较不同群落的相似性和检测污染造成的群落结构在时空上的变化。

5.随机引物扩增多态性方法（RAPD）。RAPD方法在非严格条件下运用短的任意序列引物进行PCR，使得可以同时扩增基因组的多个位点，让后将PCR产物进行凝胶电泳分析。该方法可以同时在一次试验中观测到大量DNA多态性片段，方法简单，灵敏度高，成本较低。例如运用RAPD方法分析四种受到农业污染的土壤微生物的多样性，发现土壤中的微生物数量因为使用杀虫剂而降低。但是多样性依然较高，而用过化肥的土壤中的微生物数量很高，但多样性却下降了。endprint

6.扩增片段长度多态性（AFLP）。扩增片段长度多态性是基于PCR和RFLP的一种DNA指纹技术。该技术结合PCR的高效性和RFLP的可靠性，选择性扩增基因组对基因组DNA酶切片段，通过切割两种以上的酶形成有不同酶切位点的限制酶切片段，然后在片段上增加双链人工接头，AFLP修饰了PCR的引物，结合引物与酶切片段识别序列，其核心序列与人工接头互补，从而实现了选择性扩增。该技术能有效地呈现微生物多样性程度，AFLP标记理论上数目是无限的，其重复性较好。

7.核糖体间隔序列分析（RISA）/自动核糖体间隔序列分析（ARISA）。RISA和ARISA是一种分子指纹技术，基于核糖体分析土壤微生物。它也是利用PCR技术对细菌高度可变序列IGS区域进行扩增，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳使其变性和分离，从而获取各种微生物指纹信息。ARISA不同于RISA，其正向引物用荧光标记，且自动完成测试。其灵敏性高、可重复，比RISA方法更加省时高效，不要的DNA样品也更少。目前ARISA法被广泛应用于检测土壤微生物多样性、测定污染土壤的微生物多样性、微生物群落结构的检测等方面。

三、结束语

综上所述，这些技术都可以运用在土壤微生物多樣性的检测上，每种方法都有各自的优缺点，都存在局限性。而当前最合理的方式是综合运用多种方法研究土壤微生物多样性，以获取尽量完整的信息。此外，我们有必要继续探索更新的研究技术，如果能找到更好的方法来研究土壤微生物多样性，那么我们就能更加清晰准确地解土壤微生物的种类和及其和环境之间的关系。现代分子生物学技术给我们的研究提供了更多的可能，帮助我们打开了土壤微生物世界的大门。笔者相信，有机结合现代分子生物技术与其他方法，一定能帮助我们更好地认识研究土壤微生物多样性。

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