暖季型草坪草狗牙根对酸铝胁迫的生理响应

黄春琼， 陈 振， 刘国道， 白昌军

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室， 海南 儋州 571737)

土壤酸化影响着全球30%～40%可耕地的作物生产，全世界约有40%的可耕地属酸性土壤。在中国，酸性土壤的分布遍及14个省区，总面积达203万hm2，约占全国耕地面积的21%，主要集中在南方地区[1]。铝毒害被认为是酸性土壤中限制植物生长发育的主要因素[2]。铝在土壤溶液中的形态随pH值的变化而有所不同：一般来说，当土壤pH值高于5.5时，铝被磷酸等化合物结合或被土壤胶体吸附，水溶性铝很少；而当土壤pH低于5.5时，原来在土壤中以难溶性的硅酸盐或氧化铝形式存在的铝逐渐解离，将不同形态的铝离子释放到土壤溶液中，直接危害植物生长和发育，降低酸性土壤中的农作物产量。随着工业化的发展，酸雨沉降频繁，酸性肥料投入增多，加剧了土壤的酸化，使得铝对植物的毒害日益严重[3]。在世界很多地区，尤其是中国华南热带地区，土壤酸化是草坪建植养护及牧草生产过程中的一个重要问题。

已有很多研究报道了植物的耐铝机理，关于草类植物的耐铝机制报道较少。Rengel[4]发现一年生黑麦草(Loliummultiforum)不同基因型对铝的敏感性与根系阳离子交换量呈显著负相关，低阳离子交换量的基因型能选择排斥 Al3+，减少 Al 在根系交换位点上的结合，特别是细胞壁的果胶上，从而减轻铝对根系的伤害。Wenzl等[5-6]对臂形草(Brachiariaeruciformis)的耐铝机理进行了研究。他们认为臂形草的耐铝性主要和其在酸性土壤里获得营养元素(N、P、Ca)的能力有关，并发现臂形草的根尖受到铝胁迫时内部积累有机酸而不是分泌有机酸。植物遭受某种环境的胁迫时体内自由基会增多，当自由基的浓度超过了一定的阀值，会导致蛋白质、核酸、多糖和膜脂分子的氧化破坏，从而破坏细胞内的代谢活动。在作物抗性机理研究中，过氧化物酶(Peroxidase，POD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)等酶活性的变化己广泛作为指示植物抵御逆境伤害的指标。铝胁迫能诱导多种植物体内产生大量的活性氧相关酶类活性的表达，使细胞膜脂、核酸和蛋白质等生物分子过氧化而受损害，从而破坏细胞内的代谢活动。如大麦(Hordeumvulgare)[7-8]、大豆(Glycinemax)[9]和水稻(Oryzasativa)[10]等都有相关报道。抗氧化酶类(Ascorbic acid peroxidase，APX)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)等的表达提高能缓解铝对植物的毒害[11-12]，且不同植物在遭受铝胁迫时相应的活性氧清除系统不尽相同[13-14]。因此，铝诱导的氧化胁迫及相关抗氧化酶活性的变化是铝毒的一个重要特征。

狗牙根(Cynodondactylon)是禾本科狗牙根属的多年生植物，主要生长于温暖湿润的热带及亚热带地区。广泛分布在我国长江流域以南的地区，该草种耐干旱、耐践踏、繁殖能力及再生能力强，被广泛应用于公路护坡、庭院绿化、足球场、高尔夫球场等各种草坪用草，并成为世界三大暖季型坪草中最重要的草种之一[15-16]。本研究以前期研究筛选出的5份耐铝狗牙根种质和5份铝敏感狗牙根种质为材料，研究其在酸性土壤上的生理响应情况，对培育狗牙根耐酸铝品种具有重要的理论和应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

前期利用水培法对65份狗牙根进行铝胁迫处理，通过测定地上部及根系干重对其耐铝性进行综合评价，从中筛选出5份耐铝种质和5份铝敏感种质。本研究以这5份耐铝种质和5份铝敏感种质为研究材料，其来源及耐铝评价结果如表1所示。

表1 供试狗牙根材料来源及前期耐铝评价结果Table 1 The collection site and the results of culture solution evaluation from the previous expriment of Cynodon dactylon

1.2 试验方法

1.2.1处理方法 试验土壤为花岗岩发育的砖红壤土，试验前土壤养分含量为：pH 4.6，有机质1.73%，全氮0.48 g·kg-1，全磷0.13 g·kg-1，全钾1.22 g·kg-1，碱解氮83.83 mg·kg-1，速效磷19.12 mg·kg-1，速效钾51.23 mg·kg-1，交换性铝12.3 cmol·kg-1。将风干土壤装入直径14 cm、高16 cm的塑料花盆中，每盆3.5 Kg土壤。对照用石灰调土壤pH值为5.8，石灰用量为3.8 g·kg-1，取带有一个芽的大小一致的匍匐茎段插入花盆中，每盆20个，每份种质对照(施石灰调pH值为5.8)和处理(不施石灰)各种3盆，一周后根据生长情况，每盆留苗10株，再过28 d 后结束试验，试验期间视天气情况用蒸馏水等量浇灌。

1.2.2测定项目 生长28天后，从狗牙根顶端向下取第2、3片完全展开叶进行生理指标测定。测定项目包括叶绿素、电导率、丙二醛、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、游离脯氨酸和可溶性总糖含量。叶绿素测定采用丙酮乙醇混合液法；电导率采用电导法[17]；丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸比色法；过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚比色法[18]，酶活性以每分钟内每克鲜重材料的吸光度值变化△A470表示；超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用NBT法[19]，SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活力单位；游离脯氨酸(Pro)含量的测定采用磺基水杨酸法[17]，于分光光度计520 nm波长处测定吸光度值，查标准曲线，得出脯氨酸浓度；可溶性总糖含量采用强酸可使糖类脱水生成糖醛，其与蒽酮脱水缩合形成糖醛衍生物，呈现蓝绿色，在620 nm处有最大吸收，在10～100 μg范围内其颜色深浅与可溶性总糖含量成正比这一原理来测定。

1.2.3综合评价 综合评价采用隶属函数法进行评价。Fi=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)，式中，Fi为第i个材料该性状的隶属函数值。Xij为第i个材料第j个性状的平均值，Xmax和Xmin分别为该性状的最大值和最小值。如果某一指标与综合质量成负相关，则利用反隶属函数进行转换，计算公式为：Fi=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)，最后按材料将各性状的隶属函数值进行平均，得各材料的平均隶属函数值。

1.2.4数据分析 采用Microsoft office Excel 2007计算叶绿素、电导率、丙二醛、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、游离脯氨酸和可溶性总糖含量并生成柱状图，用SAS9.0软件对各指标进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 酸铝胁迫对狗牙根叶绿素含量的影响

如图1所示，对同一处理不同种质进行方差分析，在酸铝胁迫处理下，对照间(F=13.43，Pr>F<0.0001)和处理间(F=8.57，Pr>F<0.0001)不同种质差异均达到极显著。与对照相比，狗牙根耐铝种质和铝敏感种质的叶绿素含量都有不同程度的降低，其中铝敏感种质A538和A172降低稍为明显，分别降低了29.69%和22.86%；耐铝种质A22和A84分别降低了9.58%和11.83%。

图1 酸铝胁迫对狗牙根叶绿素含量的影响Fig.1 The effect of acidity and aluminum stress on the total chlorophyll content of Cynodon dactylon accessions

2.2 酸铝胁迫对狗牙根相对电导率的影响

如图2所示，对同一处理不同种质间进行方差分析，在酸铝胁迫处理下，对照间(F=0.11，Pr>F=0.9992)和处理间(F=0.25，Pr>F=0.9817)不同种质差异均不显著。但与对照相比，狗牙根耐铝及铝敏感种质的电导率都有不同程度的增加。铝敏感种质相对电导率增加的幅度略高于耐铝种质，其中铝敏感种质A172，A137和A256分别增加了10.51%，16.93%和17.72%；耐铝种质A556，A551和A84分别增加了2.85%，6.81%和3.81%。

图2 酸铝胁迫对狗牙根相对电导率的影响Fig.2 The effect of acidity and aluminum stress on the relative electrical conductivity of Cynodon dactylon accessions

2.3 酸铝胁迫对狗牙根丙二醛含量的影响

如图3所示，对同一处理不同种质间进行方差分析，在酸铝胁迫处理条件下，对照间(F=1.22，Pr>F=0.3370)和处理间(F=1.91，Pr>F=0.1103)不同种质差异均不显著。但与对照相比，不同狗牙根种质的丙二醛含量均有不同程度增加，铝敏感种质增加较为明显，其中A172，A137，A256和A326分别增加了45.20%，56.62%，53.47%和52.30%；耐铝种质A551，A22和A84分别增加了15.38%，22.13%和1.77%。

图3 酸铝胁迫对狗牙根丙二醛含量的影响Fig.3 The effect of acidity and aluminum stress on the MDA content of Cynodon dactylon accessions

2.4 酸铝胁迫对狗牙根游离脯氨酸含量的影响

如图4所示，对同一处理不同种质间进行方差分析，在酸铝胁迫处理下，对照间(F=1.13，Pr>F=0.3855)和处理间(F=0.64，Pr>F=0.7474)不同种质差异均不显著。但与对照相比，耐铝种质和铝敏感种质的游离脯氨酸含量均发生不同程度的增加，两种类型狗牙根种质增加幅度都比较轻微，耐铝种质A556，A22和A84分别增加了1.22%，4.43%和1.80%；铝敏感种质A538，A137和A326分别增加了0.08%，0.69%和0.63%。

图4 酸铝胁迫对狗牙根游离脯氨酸含量的影响Fig.4 The effect of acidity and aluminum stress on the proline content of Cynodon dactylon accessions

2.5 酸铝胁迫对狗牙根过氧化物酶活性的影响

如图5所示，对同一处理不同种质间进行方差分析，在酸铝胁迫处理下，对照间(F=6.76，Pr>F=0.0002)差异极显著，处理间(F=2.49，Pr>F<0.0432)差异显著。与对照相比，酸铝胁迫下不同狗牙根种质的POD含量均上升，但耐铝种质增加的幅度略高于铝敏感种质，其中耐铝种质A75，A22和A84分别增加了31.47%，22.44%和31.95%，铝敏感种质 A538，A256和A326分别增加了21.24%，16.17%和0.51%。

图5 酸铝胁迫对狗牙根过氧化物酶(POD) 活性的影响Fig.5 The effect of acidity and aluminum stress on the POD activity of Cynodon dactylon accessions

2.6 酸铝胁迫对狗牙根超氧化物歧化酶活性的影响

如图6所示，对同一处理不同种质间进行方差分析，在酸铝胁迫处理下，对照间(F=6.06，Pr>F=0.0004)和处理间(F=7.85，Pr>F<0.0001)差异均呈极显著。与对照相比，不同狗牙根种质在铝胁迫处理下超氧化物歧化酶活性都有所增加，但耐铝种质增加较为明显，其中A75，A556，A551和A22分别增加了35.75%，31.32%，39.65%和31.43%；铝敏感种质增加幅度相对较小，其中A172，A137和A256分别增加了4.12%，5.57%和22.84%。

图6 酸铝胁迫对狗牙根超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响Fig.6 The effect of acidity and aluminum stress on the SOD activity of Cynodon dactylon accessions

2.7 酸铝胁迫对不同狗牙根可溶性总糖含量的影响

由图7可知，在酸铝胁迫处理下，对照间(F=28.76，Pr>F==0.0001)差异极显著，处理间(F=3.11，Pr>F=0.0165)差异显著。与对照相比，狗牙根耐铝及铝敏感种质的可溶性总糖含量都有所降低，但铝敏感种质降低较为明显，其中铝敏感种质A538，A172和A256分别降低了27.41%，15.56%，24.71%；耐铝种质A556，A22和A84分别降低了18.91%，14.29%和8.71%。

图7 酸铝胁迫对不同狗牙根可溶性总糖含量的影响Fig.7 The effect of acidity and aluminum stress on the soluble sugar content of Cynodon dactylon accessions

2.8 各指标综合评价

植物的耐铝性是一个复合性状，难以用单一指标进行评价。隶属函数分析法提供了一条在多指标测定基础上对材料特性进行综合评价的途径，可以克服仅少数指标进行评价的不足，使结果更客观、准确。因此，选取狗牙根的叶绿素、电导率、丙二醛、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、游离脯氨酸和可溶性总糖作为分析指标，计算出各指标的隶属函数值，进行综合评价，其中只有电导率和丙二醛为反隶属函数，其他均为正隶属函数。隶属函数均值越大，说明其综合评价越高。综合评价结果如表2所示，结果表明：A75的平均隶属函数值(0.7483)最大，表明其耐铝性最强，其次为A22、A556，耐铝性较强。耐铝性最差的是A326。

表2 铝胁迫下10份狗牙根种质各指标的隶属函数值Table 2 The average of membership function of 10 Cynodon dactylon accessions on aluminum soil stress

3 讨论与结论

正常情况下，植株可以通过多条途径不断产生超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢等活性氧类(reactive oxygen species，ROS)物质，这些ROS物质的产生和清除处于动态平衡状态，而逆境胁迫会打破植物体内的动态平衡，过量积累活性氧物质，导致细胞膜脂过氧化反应，影响植株的正常发育[20]。

大量研究表明铝在引起氧化胁迫的同时也可以刺激ROS有关的酶活性提高，肖祥希等[24]研究发现铝胁迫使龙眼(Euphorialongan)叶片中SOD、POD、CAT等活性升高；杨野等[25]也发现铝胁迫提高了不同种类小麦(Triticumaestivuml)活性氧代谢活性；武孔焕等[26]研究发现，与酸敏感型的黑大豆(Glycinemax)相比，耐酸型黑大豆在铝胁迫条件下具有较强的保护酶活性，其膜脂受氧化作用损伤的程度较低，从而表现出更强的耐铝胁迫能力。本研究结果显示，铝胁迫28 d 后狗牙根耐铝种质与铝敏感种质体内的MDA含量上升了，表明铝毒引起狗牙根体内产生氧化胁迫，诱使体内活性氧水平上升，膜脂发生过氧化，但耐铝种质受到的影响明显小于铝敏感种质，同时狗牙根耐铝种质SOD、POD活性的上升幅度略高于铝敏感种质，SOD、POD是植物体内清除活性氧的主要保护酶，在抵抗胁迫中承担重要作用。由此可以说明在铝胁迫下，狗牙根耐铝性种质体内的某些基因的表达，促使其抗氧化物酶活性升高，清除较多的活性氧，使其免受氧化胁迫或者降低受害程度。