五氨基乙酰丙酸对逆境下草地早熟禾萌发及生长的影响

林艳艳， 杨雪梅， 杨云贵

(西北农林科技大学动物科技学院， 陕西 杨凌712100)

草地早熟禾(Poapratensis)是常用的草坪草种，他具有根茎发达、分蘖能力极强、青绿期长等优良性状，能迅速形成密而整齐的草坪，但其对盐胁迫敏感[1]，所以目前对草地早熟禾的研究主要集中在盐碱胁迫及水肥管理等方面[2]。

伴随着工业化的发展，土壤重金属污染程度日益加重，其中金属镉(Cd)污染不仅具有不可逆性、持久性，且毒性大，难降解，污染面积大[3-4]。根据2014年国家环保部门发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，金属Cd的污染位于无机污染物点位超标率之首。金属Cd污染对农田及林地的影响受关注度较高，但对草坪的影响并未引起广泛的重视，因此文章针对Cd污染对草地早熟禾的影响设计试验。另外据联合国教科文组织(UNESCO)和联合国粮农组织(FAO)不完全统计[5]，全世界盐渍土面积约为 9.543 8亿 hm2，而盐渍土地主要分布在世界各地的干旱、半干旱地区[6-7]，陕西省大部分地区均属于干旱半干旱地区，降水量少，且水分蒸发量大。

五氨基乙酰丙酸(5-ALA)普遍存在于动、植物和微生物细胞内，是生物体内叶绿素、血红素和维生素B12等物质合成前体[8]。但5-ALA的效果发挥程度很大程度取决于5-ALA的施用浓度、方式、时间及作物种类[9]。当低浓度的5-ALA作用于根后表现为减少作物根系对Na+、K+的吸收，促进对N、P、Mg及Fe等的吸收[10]。喷施适宜浓度的5-ALA能促进低温胁迫下烟草(NicotianatabacumL.)可溶性糖和游离脯氨酸的积累,减缓叶绿素含量的下降,降低烟草叶片相对电导率和MDA含量，从而提高烟草植株的抗寒能力[11]。

综上所述，本试验探讨了草地早熟禾生长在Cd，NaCl和PEG胁迫的环境中时，外源喷施5-ALA对草地早熟禾生长产生的影响，最终提供一种保护草地早熟禾草坪的科学方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验采用草地早熟禾‘午夜’品种为材料，种子2015年10月购于江苏沭阳县卓天花卉园艺场。

1.2 试验方法

用0.5%的NaClO溶液泡种子10 min进行消毒[12]，浸泡后用自来水反复冲洗数次，再用蒸馏水清洗3次。

晾干后，将种子放在以双层滤纸为发芽床的培养皿内，皿内事先分别加蒸馏水(无胁迫)、100 mmol·L-1的NaCl、2 mg·L-1的Cd及15%PEG逆境处理液5 mL，每种处理液内分别添加不同浓度的5-ALA(0，5，25，50，100 mg·L-1)。每皿内放置100粒种子，每个处理3次重复，放入恒温光照培养箱中发芽，培养条件：温度为昼夜25℃，光照8 h，每天称重补水，每隔3天更换1次滤纸及逆境处理溶液。每天观察发芽情况，记录发芽种子的数量，连续观察萌发情况到不再变化为止。

1.3 试验测定指标

可溶性蛋白的测定：待14天发芽试验结束后，第16天称取幼苗0.02 g，放入预冷的研钵中，加入少量石英砂及1 mL蒸馏水研磨充分，并用2 mL蒸馏水将研钵洗净合并提取液转入离心管中，于5 000 g转速下离心10 min，之后取上清液0.1 mL，加入0.9 mL蒸馏水和5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，混匀，放置2 min在595 nm波长下比色，记录吸光值，根据方程计算可溶性蛋白含量[13]。用Synergy HT多功能酶标仪测定吸光值，具体操作为，从每个待测混合液中用移液枪抽取200 μL，加入到96孔酶标板中，然后放入酶标仪中测定。

样品中可溶性蛋白质的含量(μg·g-1FW)=C*Vt·FW-1*Vs-1

式中，C：查标准曲线值(μg)；Vt：提取液总体积；Vs：测定时加样量(mL)；FW：样品鲜重(g)。

每天记录各培养皿的发芽状况，直到第14天结束发芽试验，在发芽结束后从各培养皿中随机选取10株幼苗测定根长和芽长，并计算发芽势(%)、发芽率(%)、芽长、根长、芽促进率(%)、根促进率(%)。

发芽率=n14/M×100%

发芽势=n7/M×100%

芽促进率=(处理芽长-对照芽长)/对照芽长×100%

根促进率=(处理根长-对照根长)/对照根长×100%

公式中，n7,n14分别为发芽第7天和第14天的发芽种子数，M为供试种子总数(100粒)。

1.4 数据分析

采用Excel 2010进行数据统计处理和制图；采用SPSS 17.0进行单因素方差分析(ANOVA)，研究同一胁迫下不同浓度5-ALA对草地早熟禾种子萌发及幼苗生长之间的差异关系，用Duncan’s进行多重比较。

2 结果分析

2.1 不同浓度5-ALA对逆境胁迫下草地早熟禾种子萌发的影响

由图1、图2可知，5，25 mg·L-1的5-ALA对不同胁迫下早熟禾的发芽势和发芽率大致呈促进趋势，而50，100 mg·L-1的5-ALA对发芽率发芽势呈抑制状态或差异不显著。当无胁迫(H2O)存在时0，5，25 mg·L-1的5-ALA对发芽势(66%，70.7%，68%)发芽率(81.7%，79.3%，85.7%)的效应不存在显著差异，而50，100 mg·L-1的5-ALA显著(P<0.05)抑制发芽势(42. 7%，70%)和发芽率(13. 7%，54%)。2 mg·L-1的Cd胁迫下，5，25 mg·L-15-ALA显著(P<0.05)提高了种子的发芽势和发芽率；当5-ALA浓度为 50 mg·L-1时对发芽势有显著(P<0.05)抑制作用，发芽势降到23.3%，而对发芽率有显著(P<0.05)促进作用；当5-ALA浓度为100 mg·L-1时对发芽势亦有显著(P<0.05)抑制作用，而对发芽率的影响和组内对照相比差异不显著。

100 mmol·L-1的NaCl胁迫下，添加5，25，50 mg·L-1的5-ALA与对照相比均显著(P<0.05)提高了种子发芽势、发芽率，此3种浓度的5-ALA作用效果之间差异不显著，但50 mg·L-1的5-ALA促进作用高于5，25 mg·L-1；当5-ALA浓度达到100 mg·L-1时，无论对发芽势还是发芽率与组内对照相比均不存在显著差异。15%PEG胁迫下，5，50，100 mg·L-1的5-ALA对发芽势的影响不存在显著差异；而当5-ALA 浓度为25 mg·L-1时发芽势显著(P<0.05)提高到33%，比对照提高16.3%，但对发芽率无明显作用。

图1 不同胁迫处理下5-ALA对草地早熟禾种子发芽势的影响Fig.1 Effects of 5-ALA on germination energy of Poa pratensis under different stress treatments

图2 不同胁迫处理下5-ALA对草地早熟禾种子发芽率的影响Fig.2 Effects of 5-ALA on germination rate of Poa pratensis under different stress treatments

2.2 不同浓度5-ALA对逆境胁迫下草地早熟禾幼苗芽长、根长的影响

通过比较不同浓度5-ALA对不同胁迫下种子萌发状况的影响可以发现，在无胁迫时，5 mg·L-1的5-ALA对芽长的促进作用不显著；25 mg·L-1的5-ALA能显著促进幼苗芽的生长(P<0.05)，其芽长比对照长0.43 cm；而50，100 mg·L-1的5-ALA对芽长有显著抑制效应(P<0.05)，其中100 mg·L-1的抑制作用强，其芽长比对照短1.31 cm。在2 mg·L-1Cd胁迫下，未添加5-ALA的一组芽长(1.92cm)显著比无胁迫条件下芽长(0.71 cm)短；当添加了5，25，50 mg·L-15-ALA后Cd对芽长的抑制作用显著(P<0.05)得到缓解，其中25 mg·L-1的缓解作用最强，芽长可达到2.01 cm。100 mmol·L-1的NaCl胁迫下芽长的变化与Cd相似(图3)。

15%PEG胁迫下，添加5，25 mg·L-15-ALA均能显著(P<0.05)增加芽长(2.08 cm，2.20 cm)，二者的作用效果无显著差异；50 mg·L-15-ALA对芽长的作用效果不显著；当浓度达到100 mg·L-1时芽的生长被显著(P<0.05)抑制，其长度为0.90 cm(图3)。

图3 不同胁迫处理下5-ALA对草地早熟禾幼苗芽长的影响Fig.3 Effects of 5-ALA on bud length of Poa pratensis seedling under different stress treatments

由图4可知，无胁迫存在时添加5 mg·L-15-ALA后的根长(1.71 cm)与对照(1.65 cm)相比促进作用不显著；当浓度增加到25 mg·L-1时，5-ALA显著促(P<0.05)进了根的生长，根长为1.91 cm；随着浓度的继续增加，50，100 mg·L-1时对根的生长起到显著的抑制作用(0.34 cm，0.29 cm)。在2 mg·L-1Cd胁迫下，不施加五氨基乙酰丙酸时早熟禾的根生长被显著抑制，施加5，25 mg·L-15-ALA时，这种抑制作用被显著缓解，根的长度分别比对照增加(0.73 cm，0.67 cm)，而施加50，100 mg·L-1的5-ALA时，不但对根的生长没有缓解作用，反而抑制了根的伸长。

在100 mmol·L-1的NaCl胁迫下，施加5，25，50 mg·L-1的5-ALA与组内对照相比均未能显著促进根的生长，其中浓度为5，25 mg·L-1时，虽有提高根的伸长效应，但效果不显著，浓度为50 mg·L-1抑制作用亦不显著；当浓度增加到100 mg·L-1时对根长(0.17 cm)的抑制作用变得显著。在15%PEG胁迫下，0，5，25，50，100 mg·L-1的5-ALA每一组之间对根长的影响均存在显著(P<0.05)差异；其中未添加5-ALA组平均根长比无胁迫存在下未添加5-ALA组平均根长增加0.82 cm，添加5 mg·L-1的5-ALA后，根长达到2.84 cm，显著高于组内对照；当5-ALA浓度为25，50，100 mg·L-1时根长的徒增效应被显著抑制。

图4 不同胁迫处理下5-ALA对草地早熟禾幼苗根长的影响Fig.4 Effects of 5-ALA on root length of Poa pratensis seedling under different stress treatments

2.3 不同浓度5-ALA对逆境胁迫下草地早熟禾幼苗根、芽促进率的影响

通过分析根促进率及芽促进率，可以更进一步了解5-ALA对不同胁迫下幼苗生长的缓解作用。从图5可以看出，在无胁迫及Cd和NaCl的胁迫下，5，25 mg·L-1的5-ALA对根的生长均有促进作用，而50，100 mg·L-1的5-ALA对根的生长具有抑制作用；其中在无胁迫存在时5，25 mg·L-1的5-ALA对根的促进率分别为6%，15%，50，100 mg·L-1的5-ALA对根的抑制率分别为80%和83%，二者之间差异不显著。当存在Cd胁迫时，添加较低浓度的5-ALA能显著降低胁迫对根的抑制作用，当浓度升到50，100 mg·L-1时，这种抑制作用不能得到改善。在NaCl胁迫下5，25 mg·L-1的5-ALA对根的促进作用不存在显著差异，而100 mg·L-1时的抑制作用显著(P<0.05)强于50 mg·L-1。PEG胁迫下，只有5 mg·L-1的5-ALA对根的生长有促进作用，且显著高于其他浓度。

图5 不同胁迫处理下5-ALA对草地早熟禾幼苗的根促进率的影响 Fig.5 Effects of 5-ALA on inhibition rate of root length of Poa pratensis seedling under different stress treatments

而对比芽促进率(图6)可知，无论在哪种胁迫下,4个浓度的5-ALA对芽促进率的趋势是一致的，其中25 mg·L-1时的促进作用最强。当无胁迫时浓度为50，100 mg·L-1的5-ALA对芽起抑制作用；当存在Cd及PEG胁迫时，只有100 mg·L-1的5-ALA对芽的生长起显著(P<0.05)，而其他3种浓度的5-ALA均能在一定程度上缓解胁迫的抑制作用；而对于NaCl胁迫下的芽生长情况来说，4中浓度的5-ALA均能有效缓解干旱胁迫对芽生长的抑制作用。

图6 不同胁迫处理下5-ALA对草地早熟禾幼苗芽促进率的影响 Fig.6 Effects of 5-ALA on inhibition rate of bud length of Poa pratensis Poa seedling under different stress treatments

2.4 不同浓度5-ALA对逆境胁迫下草地早熟禾幼苗可溶性蛋白的影响

可溶性蛋白含量在不同胁迫下呈现的趋势不一致，无胁迫时添加25 mg·L-15-ALA后,可溶性蛋白的含量显著降低(P<0.05)，与对照相比下降了5.6 μg·g-1，而添加其他浓度的5-ALA对可溶性蛋白含量没有显著影响。在Cd胁迫下，添加4种浓度的5-ALA后,可溶性蛋白含量均比对照升高，5-ALA浓度为100 mg·L-1时可溶性蛋白含量为487 μg·g-1，显著高于对照(P<0.05)。NaCl胁迫下可溶蛋白含量的变化趋势也呈现出均比对照高，添加5，25和100 mg·L-1的5-ALA后含量显著高于对照(P<0.05)。而PEG胁迫下可溶性蛋白含量呈先降再升再降的趋势，添加25 mg·L-1的5-ALA后可溶性蛋白含量显著上升，添加100 mg·L-1的 5-ALA后可溶性蛋白含量显著降低(P<0.05)。

表1 不同胁迫处理下5-ALA对草地早熟禾幼苗可溶性蛋白含量的影响/μg·g-1Table 1 Effects of 5-ALA on soluble protein of Poa pretensis seedling under different stress treatments

3 讨论

五氨基乙酰丙酸(5-ALA)很早就受到研究者的重视[14]。他具有调节植物生长发育的功能，被视为一种新的植物生长调节物质，5-ALA在高浓度下作为无污染的天然除草剂，在低浓度下可明显增强多种植物的抗逆性[15]。所以5-ALA在当今生态环境严重恶化背景下，对提高作物生产水平具有重要的现实意义。本试验研究了金属胁迫、盐胁迫、干旱胁迫及无胁迫条件下，添加外源5-ALA对草地早熟禾幼苗产生的影响。

3.1 不同浓度5-ALA对逆境胁迫下草地早熟禾萌发的影响

外源添加较低浓度(5，25 mg·L-1)的5-ALA当无胁迫条件存在时，能提高幼苗的发芽势及发芽率，但效应不显著；当施加5-ALA的浓度逐渐升高(50，100 mg·L-1)时，显著抑制了种子的发芽势及发芽率，且浓度越高抑制作用越强，同时表现出发芽势弱于发芽率，导致发芽不整齐，幼苗苗弱的较多。而当重金属、盐及干旱胁迫存在时，随着5-ALA浓度从低到高发芽势及发芽率呈先增后降的趋势，表现出低浓度促进高浓度抑制(或效应不显著)，其中5-ALA的浓度为25 mg·L-1时表现出的缓解作用最好(盐胁迫下50 mg·L-1时表现的促进作用最优)，试验结果与李小玲等[16]研究外源ALA对盐胁迫下商洛黄芩生理特性的影响时得出的一定浓度5-ALA能提高植物抗逆性结果一致，同时印证了刘晖等[17]提出的5-ALA浓度不宜过高的结论。

3.2 不同浓度5-ALA对逆境胁迫下草地早熟禾幼苗的影响

试验结果显示，随着5-ALA浓度的增加，幼苗的根长、芽长呈现出先上升后下降的趋势，且5-ALA浓度越高对根及芽的抑制作用越强，其中25 mg·L-1的5-ALA表现出的促进作用最好。罗家传等[18]研究ALA在小麦上的生产应用效果试验发现，小麦株高随5-ALA剂量增加呈先增后减趋势，与本试验结果一致。

Cd不是植物生长必须的微量元素，其存在会对植物产生毒害[19-20]，试验中未添加5-ALA的对照组草地早熟禾的幼苗变矮、根系变短，导致幼苗的活力下降。添加了较低浓度的5-ALA后，Cd对早熟禾的毒害作用明显得到缓解，俞建良等[21]表明低浓度ALA具有促进作物应对各种恶劣生长条件(如盐碱、低温、弱光照和干旱等)的作用，但并未提到对重金属胁迫下植物的保护作用，本试验进一步证明了5-ALA提高植物应对各种逆境的能力，且与5-ALA的浓度紧密相关。

5-ALA对于盐胁迫及干旱胁迫植物的保护作用的相关研究较多，刘晖等人[18]发现，125 mmol·L-1NaCl处理下添加15～30 mg·L-1ALA可以明显缓解盐胁迫对西瓜种子萌发和幼苗生长的抑制效应；外源ALA可减轻盐胁迫对菠菜生长的抑制作用[22]。张春平等[23]研究外源5-ALA对干旱胁迫下甘草种子萌发及幼苗生理特性的影响时发现，经过5，10，15，30 mg·L-1的5-ALA处理后幼苗的胚根、胚芽均比对照长，但较高浓度(30 mg·L-1)处理效果不如低浓度，这与本试验结果相同；另外张春平等[23]刘长利[24]等的研究发现，干旱胁迫下胚芽生长受到的抑制作用程度大于胚根，这与本试验结果一致。

3.3 不同浓度5-ALA对逆境胁迫下草地早熟禾幼苗可溶性蛋白含量的影响

胁迫条件下植物积累蛋白是一种适应机制，这些蛋白不仅与调控膜的透水性有关[25]，在一定程度上还代表着植物体光合性能[26]。本试验中，Cd及NaCl处理下添加5-ALA均能导致早熟禾幼苗中可溶性蛋白含量显著升高，其中Cd胁迫下只有100 mg·L-1的5-ALA处理下可溶性蛋白含量显著(P<0.05)高于对照。在PEG模拟的干旱胁迫下，25，50 mg·L-1的5-ALA可提高幼苗的可溶性蛋白，且25 mg·L-1时提高效果显著(P<0.05)，但100 mg·L-1时可溶性蛋白含量显著低于对照(P<0.05)。这表明合理浓度的外源5-ALA可促进胁迫下早熟禾植株蛋白合成，维持植株的水分运输和叶片光合功能，从而促进植株生长并提高抗逆性。

4 结论

不同胁迫(2 mg·L-1Cd，100 mmol·L-1NaCl，15%PEG)下，外源施加相对低浓度(5，25 mg·L-1)5-ALA均能起到缓解胁迫伤害效应，而浓度逐渐升高后(50，100 mg·L-1)则起到抑制作用。具体表现为促进早熟禾种子萌发、幼苗生长和可溶性蛋白积累，其中对种子萌发及幼苗的生长作用显著，对可溶性蛋白含量的影响在不同胁迫下表现不尽相同。

综合比较4种不同浓度5-ALA对草地早熟禾萌发的作用后发现，3种胁迫处理下，以25 mg·L-1的5-ALA抗胁迫效果最优。