人工老化对纳罗克非洲狗尾草种子活力、生理生化指标的影响

马向丽， 何 超， 罗富成*， 许文花， 邓菊芬， 韩 博， 段新慧， 张桓溥

(1. 云南农业大学动物科技学院草学系， 云南 昆明 650201； 2. 成都蓉橙九天生物科技有限公司， 四川 成都 610217；3. 云南省草山饲料工作站， 云南 昆明 650225)

纳罗克非洲狗尾草(Setariasphacelata‘Narok’) 于1983 年从澳大利亚引入云南，并于1997 年11 月被登记为引进品种[1]，在我国南方地区推广种植已超过30 年。作为特色优良牧草，纳罗克非洲狗尾草在南方的种植面积不断扩大，目前仅云南省就超过7 万hm2，已成为我国南方暖温带至中亚热带草地生态建设的骨干品种。该草经济效益高，生长速度快，生长年限长，分蘖能力强，饲草粗蛋白质含量高，家畜适口性好[2-6]，但种子产量低，质量差，休眠严重，发芽率仅为10%左右[7-9]，这使得南方很多地区种子供需矛盾突出，严重制约了该优质牧草的推广利用。

种子老化是指种子自然成熟后进入衰老过程，生活力逐渐丧失。老化是种子贮藏中普遍存在的一种现象，是一个随着种子贮藏时间的延长而发生和发展的、自然而不可避免的过程[10-11]。种子老化涉及众多复杂的生理生化反应过程[12-13]。普通贮藏条件下种子自然老化非常缓慢, 人工加速老化方法是由 Delouche于 1965年首创的种子质量检验方法[14]，通过高温高湿法加速种子老化劣变，使种子活力差别加大，然后测定种子某些生理生化变化，揭示这些变化与种子生活力及活力之间的相互关系，了解种子劣变的内在机理，预测种子的耐藏力和生长表现。人工加速老化研究主要集中于粮食作物、经济作物和蔬菜种子方面，并开展了大量的标准化工作[15-18]。在牧草方面，已用于草地早熟禾(PoapratensisL.)[19]、燕麦(AvenasativaL.)[20]、高羊茅(FestucaelataKeng ex E.Alexeev.)[21]、红三叶(TrifoliumpratenseL.)[22]、草地雀麦(BromusjaponicasThunb.)[23]和多年生黑麦草(LoliumperenneL.)[24]等种类的研究。但在非洲狗尾草种子方面的研究并不多见，仅翁玲等[25]对非洲狗尾草种子人工加速老化条件进行了筛选。

本文对收获后未贮藏的非洲狗尾草种子进行人工加速老化处理，测定了老化过程中种子发芽率、酶活性、贮藏物质含量及萌发抑制物活性的变化，旨在阐明种子活力变化的内在规律，了解种子发生劣变的机理。这对非洲狗尾草种子的合理贮藏和陈种子的利用有重要意义,也可为延缓贮藏中的劣变过程提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为种植于云南农业大学草业科学实习基地的纳罗克非洲狗尾草，种子成熟收获后，随机称取清选好的净种子4份，每份10.00 g，置于40±1℃、95%RH的条件下分别进行1，2，3，4 d的加速老化。种子取出后在阴凉条件下干燥至原始含水量后备用[26]。

1.2 试验方法

1.2.1种子活力指标的测定 参考云南省地方标准《牧草种子检验章程》[27]，采用纸上发芽法，每个处理取100粒种子置于(25±1)℃、24 h光照的人工气候箱中发芽，计算种子发芽率和活力指数。计算公式如下：

活力指数=幼苗单株干重×发芽指数

1.2.2种子生理生化指标的测定 种子抗氧化酶活性和贮藏物质含量按孙群[28]的方法，其中SOD活性采用氮蓝四唑法(NBT法)，POD活性采用愈创木酚法，CAT活性采用紫外吸收法，可溶性糖含量采用蒽酮比色法，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法，MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定。各指标重复3次。

1.2.3种子萌发抑制物活性的测定 参考王炎等[29]的方法，分别称取各处理种子5.00 g，用研钵磨碎后加入适量蒸馏水，放入锥形瓶内，置于25℃恒温箱浸提24 h，过滤浸提液，残渣再浸提2次，定容至50 mL，于4℃冰箱保存备用。

参考赵敏等[30]的方法进行白菜种子萌发试验，受试白菜种子为‘水涨趴BC-1’号，纯度≥90.0%，净度≥95.0%，水份≤8.0%。以蒸馏水浇灌萌发白菜种子为对照(CK)，人工老化前后纳罗克非洲狗尾草种子蒸馏水浸提液浇灌萌发白菜种子为各处理，在铺有2 层滤纸的培养皿(d=90 mm)中，加入6 mL蒸馏水或各处理种子粗提液，于25℃下恒温培养，对照及各处理均重复3 次，每皿100 粒白菜子，24 h统计发芽率，48 h统计胚芽和胚根长。相对发芽率、相对胚芽长、相对胚根长由测量值除以对照值乘100%计算而得。

1.2.3数据分析 采用SPSS 17.0软件进行方差分析，采用Excel作图。

2 结果与分析

2.1 人工老化对种子活力的影响

2.1.1人工老化对种子发芽率的影响 随着老化处理时间的延长，纳罗克非洲狗尾草种子发芽率呈现先升高后降低的趋势(图1)。短期老化处理(1～2 d)可显著提高种子发芽率(P<0.05)。其中，以老化处理1 d时种子的发芽率最高(23.3%)，是对照(老化0 d)的1.52倍(P<0.05)，与处理2 d的种子发芽率差异不显著。老化4 d后的种子发芽率仅为12.33%，为各处理中最低，比对照下降了19.57%(P<0.05)。

图1 不同老化时间对纳罗克非洲狗尾草种子发芽率的影响Fig.1 Effect of different artificial aging timeon germination percentage of 'Narok' seeds

2.1.2人工老化对种子活力指数的影响 纳罗克非洲狗尾草种子经老化处理后，种子活力指数先升高后降低(图2)，短期老化处理(1～2 d)能显著提高种子活力(P<0.05)。处理1 d后种子活力指数达到最高值0.005，是对照(老化0 d)的1.72倍(P<0.05)，但与处理2 d的无显著差异，随着老化时间的延长，种子活力指数下降，至处理3 d后仅为0.0018，与对照相比下降了40.06%(P<0.05)。

2.2 人工老化对种子保护酶系统的影响

2.2.1人工老化对种子SOD活性的影响 人工老化处理能显著提高纳罗克非洲狗尾草种子SOD活性(P<0.05)，且增加效果随老化时间的延长先增高后降低(图3)，呈现出3个时期，骤升期：0～2 d，平稳期：2～3 d，下降期：3～4 d。老化处理第3 天SOD活性达到最高值(3348.358 U·g-1FW·h-1)，是对照(老化0 d)的 2.66倍，与处理2 d差异不显著。随着老化程度的进一步加深，SOD活性快速下降，至老化4 d时仅为2096.514 U·g-1FW·h-1，但仍比对照高出66.24%(P<0.05)。

图2 不同老化时间对纳罗克非洲狗尾草种子活力指数的影响Fig.2 Effect of different artificial aging time on vigor index of ‘Narok’ seeds

图3 不同老化处理时间对纳罗克非洲狗尾草种子保护酶活性的影响Fig.3 Effect of different artificial aging time on the activities of protective enzymes of ‘Narok’ seeds

2.2.2人工老化对种子POD活性的影响 随着老化时间的延长，纳罗克非洲狗尾草种子POD活性呈现先升高后降低的趋势(图3)，老化1～2 d种子POD活性有所提高(P<0.05)，老化处理1 d时，种子POD活性达到最高(2 870.667 U·g-1FW·min-1)，为对照(2 099.333 U·g-1FW·min-1)的1.37倍(P<0.05)，与老化处理2 d无显著差异。随着种子老化程度的进一步加深，POD活性快速下降，老化3～4 d POD活性呈降低趋势(P<0.05)。老化处理4 d后，POD活性降至最低(1 687.333 U·g-1FW·min-，)，显著低于对照(P<0.05)。

2.2.3人工老化对种子CAT活性的影响 随老化时间的延长，纳罗克非洲狗尾草种子CAT活性呈现出先升高后降低再升高的趋势(图3)。短期老化处理(1～2 d)能显著提高种子CAT活性(P<0.05)。其中，老化1～2 d的种子CAT活性持续增加，至第2天时已达183.693 U·g-1·min-1，较对照(老化0 d)提高33.26%(P<0.05)。老化3 天时种子CAT活性降至84.427 U·g-1·min-1，仅为对照的60.78%(P<0.05)，3 天后种子CAT活性又开始回升， 4 天时为139.972 U·g-1·min-1，与对照无显著差异。

2.3 人工老化对种子贮藏物质含量的影响

2.3.1人工老化对种子可溶性糖含量的影响 经老化处理后，纳罗克非洲狗尾草种子可溶性糖含量较对照均有增加(图4，P<0.05)，且随着老化时间的延长，呈现先升高(P<0.05)后基本稳定的趋势。其中，老化初期(0～2 d)可溶性糖的含量急速上升，至处理第2 天时达到16.26%，是对照的1.98 倍(P<0.05)。随后种子的可溶性糖含量略有起伏但变化不大，处理2～4 d差异不显著。

图4 不同老化时间对纳罗克非洲狗尾草种子可溶性糖含量的影响Fig.4 Effect of different artificial aging time on soluble sugar content of 'Narok' seeds

2.3.2人工老化对种子可溶性蛋白含量的影响 随人工老化处理时间的延长，纳罗克非洲狗尾草种子可溶性蛋白含量表现为先升高后降低再升高的趋势(图5)。老化1 d、3 d种子可溶性蛋白含量与对照无显著差异，老化2 d、4 d种子可溶性蛋白含量明显增加，较对照分别提高31.9%和31.3%(P<0.05)，但两者之间无显著差异。

图5 不同老化时间对纳罗克非洲狗尾草种子可溶性蛋白含量的影响Fig.5 Effect of different artificial aging time on soluble protein content of ‘Narok’ seeds

2.4 人工老化对种子抗逆性的影响

人工老化处理下纳罗克非洲狗尾草种子丙二醛含量呈上升趋势(图6，P<0.05)，且老化处理时间越长，丙二醛含量越高。至老化4天后，丙二醛含量达到0.190 μmol·g-1·FW-1，是对照(老化0 d)的2.44倍(P<0.05)。

图6 不同老化时间对纳罗克非洲狗尾草种子丙二醛含量的影响Fig.6 Effect of different artificial aging time onmalondialdehyde content of ‘Narok’ seeds

2.5 种子粗提液对白菜种子萌发的影响

不同人工老化时间的种子蒸馏水粗提液对白菜种子萌发的影响如表1所示。由表1可知，经老化处理的纳罗克非洲狗尾草种子粗提液对白菜种子萌发均有抑制作用，且随着老化时间的增加，抑制效果先减弱后增强。短期人工老化处理后(老化1～2 d)的种子粗提液对白菜发芽的抑制作用较处理前低(P<0.05)。其中，抑制作用最弱的是老化1 d种子的粗提液，此时白菜相对发芽率高达93.93%(P<0.01)。随着种子老化程度的加深，种子粗提液对白菜发芽的抑制效果增强，处理第3 d和第4 d白菜相对发芽率仅为76.11%和70.85%，与对照差异极显著(P<0.01)。

表1 种子蒸馏水粗提液对白菜种子萌发的影响Table 1 Effect of crude extract form ‘Narok’seeds distilled water on the germination percentage of cabbage seeds

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)

Note：Different lower case letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level, Different capital letters indicate significant difference at the 0.01 level

2.6 人工老化种子活力与生理生化指标的相关性分析

从表2可以看出，老化处理后的种子发芽率与POD活性呈极显著正相关关系(P<0.01)，与SOD活性呈显著正相关关系(P<0.05)，与CAT活性、可溶性糖含量呈正相关关系；与萌发抑制物活性呈极显著负相关关系(P<0.01)，与可溶性蛋白，丙二醛含量呈负相关关系。种子活力指数与POD、CAT活性呈极显著正相关关系(P<0.01)，与SOD呈正相关关系；与萌发抑制物活性呈极显著负相关关系(P<0.01)，与可溶性糖，可溶性蛋白含量呈负相关

关系。剔除无显著统计学意义的变量后，建立的种子活力指数线性回归模型为：

Y=0.303X1- 0.685X2(R2=0.806，P<0.05，N=15)

式中：

Y——发芽率；

X1——CAT活性;

X2——萌芽抑制物活性;

R2——复相关系数平方；

N——样本数。

表2 老化处理种子活力与生理生化指标相关性分析Table 2 Correlation analysis between seed vigor and physiological and biochemical index of ‘Narok’ seeds

注: *表示相关性显著(P<0.05)；**表示相关性极显著(P<0.01)

Note：* indicate significant correlation at the 0.05 level,; ** indicate significant correlation at the 0.01 level

3 讨论

短期人工加速老化可打破种子休眠，提高种子活力。在人工控制的高温高湿环境下加速种子老化，是一种比较种子活力与抗逆性的常用方法。很多植物种子经人工老化处理后出现发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数等种子活力指标下降的情况[31-33]。本研究表明，纳罗克非洲狗尾草种子在短期老化处理后(老化1～2 d)，发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数有所增加(P<0.05)，处理3 d时差异不显著，处理4 天后活力较对照显著降低(P<0.05)。出现这种不寻常的变化，可能是由于该草种子存在严重休眠，而高温高湿处理可能会打破种子休眠。翁玲等[25]早在2013年对纳罗克非洲狗尾草种子的人工老化条件进行过探讨，表明老化促进了非洲狗尾草种子发芽，与本试验结果有一定的相似性。但由于其选用的种子质量较差，原始状况不一致，最终没有筛选出非洲狗尾草种子老化的适宜温度及时间。聂朝相等[34]对结缕草(ZoysiajaponicaSteud)种子进行研究发现，高温处理一段时间后，均能不同程度地破除种子的休眠与硬实，提高种子发芽率。吴琳[35]对菠菜种子的研究证实，高温处理能有效使其木栓化的厚壁组织变得疏松，增强内果肉的透性，促进种子萌发，提高种子发芽率。蒋龙等[36]对狗尾草种子进行堆捂处理，种子的温度和湿度都会提高，此时种子的质量较好。本试验结果证明，适当的人工老化处理(高温高湿法)能提高纳罗克非洲狗尾草种子的活力，此发现将为破除此牧草的休眠提供新思路。

萌发抑制物是指可以推迟和抑制植物种子发芽的物质，由它们所诱导的休眠在自然界相当普遍，萌发抑制物存在于种子的各个部位[48]。前人研究表明，纳罗克非洲狗尾草种子属于综合休眠，可能存在萌发抑制物[8-9]。本试验采用强极性的蒸馏水浸泡用研磨研碎的种子，能将大多数萌发抑制物质从样品中提取出来，通过提取物对萌发指示植物白菜种子发芽的抑制效果，来揭示种子中萌发抑制物质的活性变化，结果表明，萌发抑制物活性呈先减小后增大的趋势。表明适当的老化处理(1～2 d)会使萌发抑制物导致的休眠逐渐消失，与种子活力呈负相关。张秋菊等[49]研究表明，返魂草(SeneciocannabifoliusLess.)种子通过50℃温水浸种能去除大部分内源抑制物质，与本研究结果一致。

人工老化处理过程中，纳罗克非洲狗尾草种子可能存在休眠破除和老化劣变两种生理变化。结合种子发芽试验，推测在种子人工老化处理过程中，可能存在着两种生理变化：(1)休眠破除；(2)老化劣变。这两种生理“作用力”在老化处理过程中可能单独施加，也可能同时存在，前者使种子活力提升，后者使种子活力下降，种子表现出的活力提高或降低，可能是他们拮抗后的合力。这也许能解释为何种子一方面表现出老化的特质，即丙二醛不断升高；同时一方面表现出种子活力上升的特质即种子发芽率、活力指数升高，抗氧化酶系统活性提高上升，贮藏物质不断累积，萌发抑制物活性的降低。这种推测是否正确，还需进行下一步研究验证。

4 结论

短期人工加速老化(1～2 d)有助于打破纳罗克非洲狗尾草种子的休眠，提高种子活力，加速老化3 d后种子活力下降。人工老化处理能显著提高纳罗克非洲狗尾草种子保护酶活性；老化处理后，纳罗克非洲狗尾草种子贮藏营养物质(可溶性糖、可溶性蛋白质)和丙二醛含量显著增加，萌发抑制物活性先减小后增大。